人食道鳞状细胞癌的应用

背景^[1-3]

人食道鳞状细胞癌来自于治疗前从一名64岁男性胸内食管中段切除的分化良好的浸润性食管鳞状细胞癌；从异种移植到无胸腺小鼠中的肿瘤细胞建立的细胞系；文献中描述可在无胸腺小鼠中异源移植，并携带p53突变和cERB B、MYC和CYCLIN D1的扩增。

人食道鳞状细胞癌

人食道鳞状细胞癌细胞培养操作

1)复苏人食道鳞状细胞癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)人食道鳞状细胞癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)人食道鳞状细胞癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人食道鳞状细胞癌可以用于具核梭杆菌促进食道鳞状细胞癌化疗耐药的机制研究

肠道微生物具核梭杆菌已被证实与胃肠道肿瘤的发生发展密切相关,尤其在结直肠癌及食道癌患者中,具核梭杆菌的富集与疾病预后不良有关。化疗目前仍然食道癌重要治疗策略。然而,化疗耐药被视为改善食道癌患者预后的主要障碍,为了提高食道癌患者的生存率,深入了解食道癌的化疗耐药的机制非常有必要的。本文主要研究具核梭杆菌通过调节自噬通路,促进食道鳞状细胞癌对化疗药物产生耐药,有助于发现具核梭杆菌在食道癌发生发展的作用及新机制。

研究方法:利用120例食管鳞状细胞癌临床标本,qPCR方法检测肿瘤内具核梭杆菌DNA含量,并与化疗反应(RECIST、SUV值、肿瘤消退分级)的关系进行统计学分析。利用具核梭杆菌与食道鳞状细胞癌细胞TE8及TE10共培养,通过透射电镜及共聚焦显微镜观察细菌粘附,侵入行为并检测自噬情况,分别加入化疗药物5-氟尿嘧啶,顺铂、多西紫杉醇,自噬抑制剂氯喹及抗生素,利用IncuCyte进行细胞增殖、细胞凋亡的检测及使用免疫印迹分析等方法检测食道鳞癌的自噬及耐药相关蛋白表达。

免疫组化检测284例食道鳞癌样本的ATG7蛋白表达,进一步证明具核梭杆菌的DNA含量与食道鳞状细胞癌的自噬水平相关。

结果:利用qPCR方法验证食道鳞状细胞癌患者肿瘤内具核梭杆菌DNA水平与新辅助化疗及辅助化疗的疗效呈负相关。在细胞实验中,发现具核梭杆菌作为胞内菌,可以粘附和侵入到食管鳞癌细胞内并存活,促进癌细胞的增殖及抑制凋亡,对多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶和顺铂产生耐药性,并可以诱导食道鳞癌细胞自噬的发生,上调自噬蛋白ATG7及Beclin-1表达,促进LC3B II/I比值的升高,通过加入ATG7的小干扰RNA,自噬抑制剂氯喹或使用抗生素,可以逆转具核梭杆导的食道鳞癌细胞的化疗耐药,在284个临床样本中也验证了肿瘤内具核梭杆菌的DNA含量与ATG7的表达水平呈正相关。

结论:具核梭杆菌可以通过上调ATG7,促进食道鳞状细胞癌的自噬,继而诱导食道鳞癌细胞产生化疗药物耐药。

参考文献

[1]Dietary fat,bile acid metabolism and colorectal cancer.Ocvirk Soeren;O’Keefe Stephen J.D..Seminars in Cancer Biology,2020

[2]Modulating gut microbes..Wargo Jennifer A.Science(New York,N.Y.),2020

[3]Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy..Mager Lukas F;Burkhard Regula;Pett Nicola;Cooke Noah C A;Brown Kirsty;Ramay Hena;Paik Seungil;Stagg John;Groves Ryan A;Gallo Marco;Lewis Ian A;Geuking Markus B;McCoy Kathy D.Science(New York,N.Y.),2020

[4]Gut microbiome in HCC-Mechanisms,diagnosis and therapy..Schwabe Robert F;;Greten Tim F.Journal of hepatology,2020

[5]刘洋.具核梭杆菌促进食道鳞状细胞癌化疗耐药的机制研究[D].中国医科大学,2021.