人涎腺腺样囊性癌细胞的应用

背景^[1-3]

人涎腺腺样囊性癌细胞源自一位28岁男性腺样囊性癌患者，人腭部小涎腺腺样囊性癌组织小块静置培养7天细胞开始生长，首次传代50天，BALB/C,CBA,Swiss，DF裸小鼠皮下移植成瘤，表达角蛋白。STR检测发现该细胞被HeLa细胞污染。

人涎腺腺样囊性癌细胞

人涎腺腺样囊性癌细胞培养步骤：

人涎腺腺样囊性癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人涎腺腺样囊性癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人涎腺腺样囊性癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

三．人涎腺腺样囊性癌细胞处理：

1）复苏人涎腺腺样囊性癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人涎腺腺样囊性癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人涎腺腺样囊性癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）人涎腺腺样囊性癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1，人涎腺腺样囊性癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人涎腺腺样囊性癌细胞可以用于茉莉酸甲酯对人涎腺腺样囊性癌细胞生长抑制作用及其机制的实验研究

以腺样囊性癌ACC-2细胞为研究对象,通过体外实验研究,从细胞和分子水平上观察Me-Ja对ACC-2细胞株的作用,探讨其可能存在的机制,为Me-Ja抗SACC作用的进一步研究提供理论以及实验依据。

方法：1.体外培养ACC-2细胞,运用CCK-8法筛选茉莉酸甲酯的有效作用浓度及增值抑制率测定；倒置显微镜观察各组细胞形态变化；透射电镜下观察各组细胞的超微结构；流式细胞术检测细胞周期分布。

2. 应用RT-PCR技术及免疫细胞化学SP法分别检测各组ACC-2细胞中Bcl-2、Bax mRNA和蛋白的表达强度。

3. 实验分组：空白对照组、5-Fu组、Me-Ja组、Me-Ja+5-Fu组。

结果：1.CCK-8法检测各浓度梯度Me-Ja作用不同时间对ACC-2细胞增殖抑制率结果：Me-Ja对ACC-2细胞具有增殖抑制作用,这种作用随Me-Ja作用浓度的增加、作用时间的延长而增大,呈现浓度和时间依赖性。

2. Me-Ja对ACC-2细胞的半数抑制浓度IC50结果：Me-Ja对ACC-2细胞半数抑制浓度IC50为9.20μmol/L。后续试验Me-Ja浓度采用1/2IC50,即4.6μmol/L。

3. 倒置显微镜下观察Me-Ja作用后ACC-2细胞的形态学变化结果：空白对照组：ACC-2细胞贴壁生长,细胞呈梭形、多边形,异型性明显。5-Fu组和Me-Ja组及联合作用组均可见部分细胞脱落,贴壁细胞明显减少。Me-Ja+5-Fu组脱落细胞更多,贴壁细胞数目较单药作用组更少。

4. CCK-8法检测各组ACC-2细胞增殖抑制率结果：5-Fu组为44.22%,Me-Ja组为44.92%,Me-Ja+5-Fu组为49.30%。5-Fu与Me-Ja单独作用组之间相比,P>0.05,联合作用组与单药作用组相比P<0.05,说明5-Fu与Me-Ja单独作用对ACC-2细胞的增值抑制率无明显差别,联合用药效果优于单独用药。

5. 透射电镜下观察各组ACC-2细胞超微结构结果：空白对照组ACC-2细胞幼稚,分化程度低,增殖力强,属恶性肿瘤细胞的典型特征。5-Fu组和Me-Ja组及联合作用组均可见到部分细胞表面微绒毛消失,细胞之间连接变少甚至消失,部分细胞呈现凋亡改变,联合作用组尤其明显。

6. 流式细胞术检测各组ACC-2细胞周期分布结果：空白对照组：ACC-2细胞有40.8%处于G1期,有24.6%处于S期；5-Fu组：有55.9%的细胞处于G1期；17.2%的细胞处于S期；细胞阻滞于G1期；Me-Ja组：62.1%的细胞处于G1期,17.3%的细胞处于S期,细胞也阻滞于G1期；亚二倍体峰出现,说明部分细胞出现凋亡。Me-Ja+5-Fu组：61.2%的细胞处于G1期,仅7.1%的细胞处于S期,细胞G1期阻滞效果更明显,典型凋亡亚二倍体峰可见,更多细胞出现凋亡。

7. RT-PCR法检测各组ACC-2细胞Bcl-2和Bax mRNA表达结果：Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分别作用48h后,ACC-2细胞内Bcl-2mRNA的表达水平相对空白对照组均明显下降(P<0.05),而Bax mRNA的表达水平相对空白对照组明显升高(P<0.05)。

8. 免疫细胞化学SP法检测Bcl-2和Bax蛋白结果：Me-Ja、5-Fu和Me-Ja+5-Fu分别作用48h后,各实验组ACC-2细胞内Bcl-2蛋白在胞浆中表达水平均明显低于对照组(p<0.05),而Bax蛋白的表达水平较对照组也明显增加(P<0.05)。

参考文献

[1]Jasmonates induce nonapoptotic death in high‐resistance mutant p53‐expressing B‐lymphoma cells.OritFingrut;DoritReischer;RonitRotem;NataliaGoldin;IritAltboum;IsraelZan‐Bar;EliezerFlescher.British Journal of Pharmacology,2009

[2]Effects of natural and novel synthetic jasmonates in experimental metastatic melanoma.DReischer;AHeyfets;SShimony;JNordenberg;YKashman;EFlescher.British Journal of Pharmacology,2009

[3]PI3K/Akt Pathway Activation Attenuates the Cytotoxic Effect of Methyl Jasmonate Toward Sarcoma Cells.Uri Elia;;Eliezer Flescher.Neoplasia,2008

[4]Methyl jasmonate induces cell death with mixed characteristics of apoptosis and necrosis in cervical cancer cells.Tatiana Kniazhanski;;Anna Jackman;;Alina Heyfets;;Pinhas Gonen;;Eliezer Flescher;;Levana Sherman.Cancer Letters,2008

[5]赵海东.茉莉酸甲酯对人涎腺腺样囊性癌细胞生长抑制作用及其机制的实验研究[D].郑州大学,2013.