IM 9的应用

背景^[1-3]

IM 9分离自多发性骨髓瘤的外周血B淋巴细胞，属于淋巴母细胞样悬浮细胞。

IM 9

IM 9培养操作:

1）复苏IM 9细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）IM 9细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）IM 9细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

IM 9可以用于TLR7/8活化对潜伏感染B淋巴瘤细胞中EBV基因表达的影响及其机制的研究

探究了TLR7/8活化与潜伏状态EBV之间的关系,对于揭示EBV逃逸宿主免疫监视点的分子机理具有重要生物学意义,同时相关结果也对TLR7/8激动剂的应用范围评价具有一定的理论研究意义和临床应用价值。

1. EBV能够限制R848诱导的TLR7/8通路的活化程度。以EBV-B淋巴瘤细胞Ramos和EBV+B淋巴瘤细胞IM9为研究对象,使用TLR7/8的激动剂R848诱导后,在两种细胞中的TLR7/8通路活化程度不同。R848刺激后Ramos中TLR7/8通路下游核转录因子NF-k B(Fold Change=92,p=0.024)、炎症因子TNF-α(Fold Change=15,p=0.01)与IL-6(Fold Change=23,p=0.002)、以及Ⅰ型干扰素IFNα(Fold Change=300,p=0.002)与IFNβ(Fold Change=180,p>0.05)在转录水平都显著升高而在R848刺激后的IM9中,NF-k B、TNF-α与IL-6较对照组无明显变化,IRF5、IFNα与IFNβ仅升高4倍左右。

2. 造成IM9细胞中TLR7/8活化程度受限的原因可能为EBV转录组水平,尤其是立即早期基因的表达量升高。R848能够引起IM9中潜伏状态的EBV部分基因的m RNA水平尤其是起始裂解的立即早期基因(BZLF1、BRLF1)显著升高,且在短期(0-24h)及长期(0-1week)内均呈现动态变化。而R848处理后并无任何裂解复制相关的蛋白的产生,不能诱导EBV从潜伏向裂解状态的转化。此外,R848对于EBV的调控作用还表现在能够降低细胞内/外EBV DNA含量。另一方面,通过CCK8及流式细胞检测发现,R848并未引起宿主IM9的细胞活性、凋亡水平以及细胞周期的改变。因此,在IM9细胞的EBV与宿主相互作用中,EBV m RNA尤其是立即早期基因可能是关键因素。

3. EBV引发TLR7/8活化受限的潜在机制可能与立早基因启动子区部分基因甲基化水平改变有关,并存在复杂的病毒宿主互作因素。通过克隆子测序,发现R848诱导立早期基因BRLF1启动子区甲基化水平降低,这可能与立早基因的表达量升高有关;IM9转录组测序结果显示,R848刺激后宿主细胞存在活化的细胞进程等生物学过程,涉及代谢等信号通路;差异表达基因深入分析发现,IER3等基因的表达变化,可能通过影响NF-k B的表达最终导致TLR7/8通路的限制性激活。

综上所述,TLR7/8的活化能够诱导EBV转录组水平立早基因等显著上调,其机理可能与BRLF1启动子部分区域的甲基化水平改变有关,并涉及多种生物过程、信号通路和病毒与宿主的相互作用。相关结果为揭示EBV逃逸TLR7/8天然免疫分子机理以及临床免疫佐剂应用范围与抗病毒药物研发提供线索。

参考文献

[1]Transcriptional and chromatin regulation in interferon and innate antiviral gene expression.Nancy Au-Yeung;;Curt M.Horvath.Cytokine and Growth Factor Reviews,2018

[2]The inhibition of malignant melanoma cell invasion of bone by the TLR7 agonist R848 is dependent upon pro-inflammatory cytokines produced by bone marrow macrophages..Manome Yoko;;Suzuki Dai;;Mochizuki Ayako;;Saito Emi;;Sasa Kiyohito;;Yoshimura Kentaro;;Inoue Tomio;;Takami Masamichi;;Inagaki Katsunori;;Funatsu Takahiro;;Kamijo Ryutaro.Oncotarget,2018

[3]EBV induces persistent NF-κB activation and contributes to survival of EBV-positive neoplastic T-or NK-cells..Honami Takada;;Ken-Ichi Imadome;;Haruna Shibayama;;Mayumi Yoshimori;;Ludan Wang;;Yasunori Saitoh;;Shin Uota;;Shoji Yamaoka;;Takatoshi Koyama;;Norio Shimizu;;Kouhei Yamamoto;;Shigeyoshi Fujiwara;;Osamu Miura;;Ayako Arai.PLoS ONE,2017

[4]TLR7 and TLR8 agonist resiquimod(R848)differently regulates MIF expression in cells and organs.Yao Mawulikplimi Adzavon;;Pengxiang Zhao;;Baobei Lv;;Mengyu Liu;;Xin Zhang;;Fei Xie;;Linqi Yang;;Lei Shang;;Mingzi Zhang;;Qinjian Li;;Xuemei Ma.Cytokine,2017

[5]张旭娟.TLR7/8活化对潜伏感染B淋巴瘤细胞中EBV基因表达的影响及其机制的研究[D].北京工业大学,2019.