大鼠主动脉平滑肌细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠主动脉平滑肌细胞是以大鼠主动脉为材料经过酶消化制的原代成纤维细胞细胞系。血管平滑肌细胞是许多重大动脉疾病的细胞底物。血管平滑肌细胞的不断增长是损伤性血管病变形成、动脉疾病发展的重要原因。体外培养血管平滑肌细胞是研究在血管病变发生过程中细胞及分子改变的基础。此外平滑肌细胞具有产生结缔组织和基质的功能，因此动脉平滑肌细胞是研究动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄以及高血压等疾病发病机制和防治工作的重要对象。

大鼠主动脉平滑肌细胞

大鼠主动脉平滑肌细胞分离步骤：

1、颈椎脱臼处死大鼠，75%酒精浸泡3～5min，无菌条件下打开胸腔，将大鼠左肺向右侧翻转，可见贴于脊柱右侧胸主动脉走行。上端沿主动脉弓，下端至膈的主动脉裂孔处，完整剪取胸主动脉，置于预先装有PBS的无菌培养皿中；

2、用镊子轻轻剥离血管外结缔姐织，移至另一装有PBS的无菌培养皿；

3、用眼科剪沿纵轴剪开血管条，无菌镊轻轻刮除内膜，移至另一无菌培养皿；

4、用镊子钝性加压刮中膜2次，待出现裂口后夹住中膜将其取下；

5、将取下的中膜加入含20%FBS的DMEM培养液，用眼科剪剪碎血管条，使组织块大小约1mm×1mm×lmm;

6、用无菌滴管将组织块吸入细胞培养瓶，均匀铺于瓶壁，间距约0.2～0.5cm;

7、将培养瓶直立放置于37℃/5%CO2细胞培养箱；

8、1h后轻轻放平，37℃/5%CO2细胞培养箱中绝对静置3d;

9、此后每3d换液1次；

10、培养出来的VSMC及时传代及冻存于液氮，3～8代用于后续实验。

应用^[4][5]

大鼠主动脉平滑肌细胞可以用于法舒地尔对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响及Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的作用

通过观察法舒地尔对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响并探讨其可能的分子生物学机制。以求进一步了解法舒地尔对血管再狭窄药理作用，并期望其能成为预防治疗动脉狭窄介入术后再狭窄的新型药物。

方法:提取培养SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞，待细胞生长至70%80%汇合后换用无血清培养液饥饿培养24h，使细胞处于静止期，然后换用含10%FBS的培养液，分别加入不同浓度(1,10,100μmol/L)的法舒地尔孵育48h，收集细胞用于下列实验。实验共分为五组：A组：无血清组；B组：血清组；C组：血清+1μmol/L法舒地尔干预组；D组：血清+10μmol/L法舒地尔干预组；E组：血清+100μmol/L法舒地尔干预组。通过MTT法，BrdU法及划痕试验测定血管平滑肌细胞的增殖和迁移；应用流式细胞法测定血管平滑肌细胞周期及细胞凋亡；应用Western免疫印迹法测定Ras-MEK1/2-ERK1/2以及Akt蛋白通路的磷酸化水平。

结果：(1)法舒地尔以剂量依赖性方式抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移：MTT检测结果表明，法舒地尔可显著抑制体外培养的VSMC增殖，并具有明显的量效关系(P<0.05)。在法舒地尔1,10,100μmol/L范围内，随着浓度的升高，VSMC的增殖活力逐渐下降，与对照组相比，分别下降2.04%,8.98%,30.39%(24h);6.17%,23.36%,59.82%(48h)。BrdU检测结果表明，法舒地尔可显著抑制体外培养的VSMC增殖，并具有明显的量效关系(P<0.05)。在法舒地尔1,10,100μmol/L范围内，随着浓度的升高，VSMC的增殖活力逐渐下降，与血清组相比，分别下降9.94%39.36%49.37%(24h);7.38%,57.26%,70.74%(48h).

(2) 法舒地尔以剂量依赖性方式阻断细胞周期从G0/G1期过度到S期：分别用1、10、100μmol/L法舒地尔作用于VSMC24h,G0/G1期细胞逐渐增多(5.1%,14.2%,22.4%)，S期细胞逐渐减少(3.9%，14.8%，19.1%)，表明法舒地儿可抑制血管平滑肌细胞进入S期(P<0.05)。

(3) 法舒地尔以剂量依赖性方式抑制血管平滑肌细胞早期凋亡和晚期细胞凋亡：法舒地尔对细胞凋亡的影响通过流式细胞术测定，结果显示：1、10、100μmol/L法舒地尔作用VSMC48h,早期凋亡及晚期凋亡细胞逐渐增多，并随剂量的增加而递增。表明法舒地尔可促进血管平滑肌细胞凋亡(P<0.05)。

(4) 法舒地尔以剂量依赖性方式通过抑制Ras-MEK1/2-ERK1/2通路起到其抗增殖效果：通过10%FBS刺激诱导Ras通路激活后加入法舒地尔，结果显示：Ras通路的表达明显减少，并呈现剂量依赖效应(P<0.05)。

作为Ras下游的激酶，我们也检测了磷酸化和非磷酸化的MEK1/2和ERK1/2的蛋白表达，结果显示：应用法舒地尔后，以剂量依赖的形式抑制了MEK1/2和ERK1/2通路的磷酸化表达(P<0.05)，另外，P13k-Akt通路也显示可以介导FBS诱导的血管平滑肌细胞的迁移和增殖，法舒地尔是否通过这一通路起作用在本研究中被调查，结果显示：FBS诱导了Akt的激活，但应用法舒地尔后没有发现其对Akt磷酸化的抑制效果(P>0.05).

结论:法舒地尔通过对Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的抑制作用以及对细胞凋亡的促进作用实现对血管平滑肌细胞增殖的抑制。

参考文献

[1]Cyclophilin A Promotes Cardiac Hypertrophy in Apolipoprotein E–Deficient Mice.Kimio Satoh;;Patrizia Nigro;;Asad Zeidan;;Nwe Nwe Soe;;Fabrice Jaffré;;Masayoshi Oikawa;;Michael R.O?Dell;;Zhaoqiang Cui;;Prashanthi Menon;;Yan Lu;;Amy Mohan;;Chen Yan;;Burns C.Blaxall;;Bradford C.Berk.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2011

[2]Abstract 11001:Cyclophilin a Mediates Pulmonary Vascular Remodeling by Rho-Kinase Activation in Patients With Pulmonary Hypertension.Kimio Satoh;;Yoshihiro Fukumoto;;Koichiro Sugimura;;Shunsuke Tatebe;;Yutaka Miura;;Saori Miyamichi;;Kazufumi Nakamura;;Patrizia Nigro;;Bradford C Berk;;Hiroaki Shimokawa.Circulation,2010

[3]Abstract 16516:ROCK2 in Vascular Smooth Muscle Cells Plays a Crucial Role for Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension in Mice.Toru Shimizu;;Kimio Satoh;;Shin-ichi Tanaka;;Yoshihiro Fukumoto;;Hiroaki Shimokawa.Circulation,2010

[4]Sphingosine-1-phosphate receptor-2 deficiency leads to inhibition of macrophage proinflammatory activities and atherosclerosis in apoE-deficient mice.Wang,Fei;Okamoto,Yasuo;Inoki,Isao;Yoshioka,Kazuaki;Du,Wa;Qi,Xun;Takuwa,Noriko;Gonda,Koichi;Yamamoto,Yasuhiko;Ohkawa,Ryunosuke;Nishiuchi,Takumi;Sugimoto,Naotoshi;Yatomi,Yutaka;Mitsumori,Kunitoshi;Asano,Masahide;Kinoshita,Makoto;Takuwa,Yoh.Journal of Clinical Investigation,2010

[5]江金垚.法舒地尔对大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的影响及Ras-MEK1/2-ERK1/2通路的作用[D].河北医科大学,2013.