SV-HUC-1的应用

背景^[1-3]

SV-HUC-1(人输尿管上皮永生化细胞)，是由猿猴空泡病毒40转染至1名11岁男孩的泌尿道上皮细胞，而建立起来的永生化细胞系。其分化特性与正常细胞相似，培养简单，可无限传代，却不属于肿瘤细胞。

SV-HUC-1

SV-HUC-1细胞培养步骤:

一．SV-HUC-1培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）SV-HUC-1培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）SV-HUC-1冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．SV-HUC-1细胞处理：

1）复苏SV-HUC-1细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）SV-HUC-1细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁SV-HUC-1细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。

SV-HUC-1细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．SV-HUC-1细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

SV-HUC-1可以用于氯胺酮（K粉）在膀胱上皮细胞凋亡中的作用机理研究

通过分析用氯胺酮刺激人膀胱SV-HUC-1细胞后,诱导其发生细胞凋亡,为初步探讨氯胺酮相关性泌尿系统损伤的发病机制提供理论基础。

方法：培养人膀胱SV-HUC-1永生化上皮细胞系,用不同浓度(Ommol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L)的氯胺酮刺激SV-HUC-1细胞24小时,用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率,Western免疫印迹法检测Bax、Bcl-2、pro-caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表达的相对含量,并选取上述实验中结果的氯胺酮浓度作为下一步实验的工作浓度,继续作用于SV-HUC-1细胞不同的时间后行上述实验。实验数据使用SPSS19.0统计软件进行统计分析。

结果：1.氯胺酮对SV-HUC-1细胞凋亡率的影响0mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、2mmol/L的氯胺酮作用SV-HUC-1细胞24小时后,流式细胞术检测结果显示各组细胞凋亡比率分别为(3.33±0.24)%、(5.16±0.57)%、(9.39±0.52)%、(11.33±0.40)%,各组间比较P值均<0.05。相关分析结果显示,SV-HUC-1细胞凋亡率与氯胺酮质量浓度呈正相关(r=0.829,P<0.05)。用2mmol/L的氯胺酮分别作用SV-HUC-1细胞0h、12h、24h、48h后,流式细胞术检测显示各组细胞凋亡比率分别为(3.72±0.22)%、(6.45±0.32)%、(11.18±0.45)%、(12.24±0.40)%,各组间比较P值均<0.05。相关分析结果显示,SV-HUC-1细胞凋亡率与氯胺酮作用时间呈正相关(r=0.762,P<0.05)。

2. 氯胺酮对SV-HUC-1细胞Bax、Bcl-2、pro-caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白的表达的影响O mmol/L、0.5mmol/L.1mmol/L.2mmol/L的氯胺酮作用于SV-HUC-1细胞24小时后,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白(17KD.19KD)的表达较对照组明显增多,Bax/Bcl-2比值增大(P<0.05),且随氯胺酮浓度的升高而表达增高(rBax=0.986,r19KD=0.888,r17KD=0.769,r Bax/Bcl-2=0.982,P值均<0.05)；Bcl-2和pro-caspase-3蛋白表达较对照组逐渐下降(P<0.05),且随氯胺酮浓度的升高而表达下降(r Bcl-2=-0.963,r pro-caspase-3=-0.894,P值均<0.05)。氯胺酮(2mmol/L)作用于SV-HUC-1细胞Oh、12h、24h、48h后,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白(17KD.19KD)的表达较对照组增多,Bax/Bcl-2比值增大(P<0.05),随作用时间的延长而表达增多(r Bax=0.951,r19KD=0.787,r17KD=0.942,r Bax/Bcl-2＝0.979,P值均<0.05)；Bcl-2和pro-caspase-3蛋白表达较对照组逐渐下降(P<0.05),且随作用时间的延长而表达下降(r Bcl-2:=-0.949,r pro-caspase-3=-0.914,P值均<0.05)。

结论：氯胺酮能够诱导人膀胱SV-HUC-1细胞系发生细胞凋亡,并呈浓度依赖性和时间依赖性。说明了氯胺酮可能诱导尿路上皮细胞发生凋亡,导致尿路上皮层变薄或上皮缺损,进一步对上皮下肌层组织造成损害,这可能是氯胺酮相关性泌尿系统损伤,在疾病发病早期的一个重要机制。

参考文献

[1]An evaluation of the efficacy of different doses of ketamine for treatment of catheter-related bladder discomfort in patients underwent urologic surgery:A prospective,randomized,placebo-controlled,double-blind study.Mohammadreza Safavi;;Azim Honarmand;;Mohammadali Atari;;Shirin Chehrodi;;Mahsa Amoushahi.Urology Annals,2014

[2]Effects of Intra-Operative Ketamine Administration on Postoperative Catheter-Related Bladder Discomfort:A Double-Blind Clinical Trial.Reza Shariat Moharari;;Mahbod Lajevardi;;Mohammadreza Khajavi;;Atabak Najafi;;Gazelle Shariat Moharari;;Farhad Etezadi.Pain Practice,2014

[3]Effects of long‐term ketamine administration on rat bladder protein levels:A proteomic investigation using two‐dimensional difference gel electrophoresis system.Di Gu;;Jun Huang;;Zhengfei Shan;;Youle Yin;;Shaobin Zheng;;Peng Wu.Int J Urol,2013

[4]Ketamine is associated with lower urinary tract signs and symptoms.R.Pal;;S.Balt;;E.Erowid;;F.Erowid;;M.J.Baggott;;J.Mendelson;;G.P.Galloway.Drug and Alcohol Dependence,2013

[5]黄亮.氯胺酮（K粉）在膀胱上皮细胞凋亡中的作用机理研究[D].中南大学,2014.