HeLa的应用

背景^[1-3]

HeLa细胞系是源自一位美国黑人妇女海瑞塔‧拉克斯（Henrietta Lacks）的宫颈癌细胞的细胞系。一位外科医生从她的肿瘤上取下组织样本，并在实验室中进行培养，仍被不间断的培养。

HeLa

不同于其他一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去。此细胞系跟其他癌细胞系相比，增殖异常迅速。

HeLa细胞是一种人工培养、具有无限增殖能力的细胞，自诞生以来到2019年已经68年了。在医学界，海拉细胞被广泛应用于肿瘤研究、生物实验或者细胞培养，已经成为医学研究中非常重要的工具。这种细胞是现有来自人体的组织培养中最早的分离细胞，在世界各地的研究室继续培养，广泛应用于各种研究。它们在体外容易增殖形成上皮性的细胞排列。染色体数频率分布式为78-80，移植于人体皮下则形成肿瘤，在豚鼠的眼前房，大鼠的颊囊以及经X射线皮质酮处理的小鼠可作异种移植，由此可以认为仍保持着癌的性状。广泛被用作分析细胞营养要求、细胞增殖和各种细胞化学的研究材料。易从细胞群落作无性繁殖系分离，有各种变异系的报道。对脊髓灰质炎病毒、腺病毒等的病毒有敏感性，并显示有明显的细胞变性，在病毒研究方面的利用价值颇大。

HeLa细胞系培养操作:

1）复苏HeLa细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）HeLa细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗C2C12细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察HeLa细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）HeLa细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.HeLa细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

HeLa可以用于二甲双胍通过影响肌动蛋白骨架重组抑制人宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭和增殖的研究

二甲双胍对He La细胞肌动蛋白骨架重组的影响,及其影响增殖、迁移和侵袭的过程中coflin的变化,并探讨相关机制。

方法:应用细胞增殖及毒性(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂盒检测0、5、10、20 mmol/L二甲双胍分别处理Hela细胞12h、24h和48h后细胞活力的变化;使用二甲双胍处理He La细胞并进行划痕实验、transwell迁移和侵袭、细胞克隆形成实验,检测二甲双胍对He La细胞增殖、迁移和侵袭的影响;罗丹明标记的鬼笔环肽染色Hela细胞的丝状肌动蛋白(Filamentous actin,F-actin),观测荧光显微镜下F-actin的荧光强度变化;检测二甲双胍处理He La细胞各时间点(3h、6h、12h和24h)F-actin荧光强度变化;激光共聚焦显微镜观察二甲双胍处理He La细胞后肌动蛋白骨架结构应力纤维(Stress fiber)的变化;检测cofilin及其上游LIMK1、ROCK1和Rho A的基因和蛋白表达变化。

结果：CCK-8细胞活力检测显示:随着二甲双胍浓度和处理时间的增加,He La细胞活力下降(P<0.05)。划痕实验结果显示,二甲双胍组12h、24h和48h的迁移率都小于NC组(P>0.05;P<0.01;P<0.05)。Transwell迁移和侵袭实验显示,二甲双胍组迁移或侵袭至小室背面的细胞数少于NC组(P<0.05;P<0.01)。细胞克隆形成实验显示,相较于二甲双胍处理组,NC组拥有更多且明显的结晶紫染色成蓝紫色的细胞团(P<0.01)。荧光显微镜下,5 mmol/L二甲双胍处理He La细胞24h后F-actin荧光强度增加;在5 mmol/L二甲双胍处理He La细胞3h、6h、12h和24h的四个时间点,He La细胞F-actin荧光强度均高于NC组(P<0.01、P<0.01、P<0.05和P<0.01)。激光共聚焦显微镜显示:肌动蛋白骨架结构应力纤维荧光强度增加、应力纤维束之间聚拢变粗、分布在细胞边缘且出现新的极化方向;细胞的最长径减短(P<0.05),极性降低。

提示:二甲双胍引起He La细胞肌动蛋白骨架结构和分布的改变。RT-PCR结果显示:Rho A、LIMK1和Cofilin1的m RNA表达增加(P<0.01),ROCK1不具有统计学差异。蛋白免疫印迹显示:总的AMPK蛋白表达不变,p-AMPK蛋白表达增加(P<0.01),二甲双胍激活AMPK;总cofilin蛋白表达不变,p-cofilin增加(P<0.05)。提示:二甲双胍抑制cofilin蛋白的活性。Rho A、ROCK1和LIMK1蛋白表达增加(P<0.05、P<0.05和P<0.01)。

结论:1、二甲双胍可抑制He La细胞的增殖、迁移和侵袭。2、二甲双胍影响He La细胞肌动蛋白骨架的重组,并引起肌动蛋白骨架结构应力纤维的变化。3、cofilin蛋白磷酸化增加可影响He La细胞肌动蛋白骨架的重组,进而抑制He La细胞的迁移、侵袭和增殖。

参考文献

[1]Metastasis and Tumor Cell Migration of Solid Tumors.Hoeppner Jens;Bronsert Peter.Cancers,2021

[2]Cofilin:A Promising Protein Implicated in Cancer Metastasis and Apoptosis.Xu Jing;Huang Yan;Zhao Jimeng;Wu Luyi;Qi Qin;Liu Yanan;Li Guona;Li Jing;Liu Huirong;Wu Huangan.Frontiers in Cell and Developmental Biology,2021

[3]Actin dynamics during tumor cell dissemination..Mondal Chandrani;Di Martino Julie S;BravoCordero Jose Javier.International review of cell and molecular biology,2021

[4]Human papillomavirus and cervical cancer..Okunade Kehinde Sharafadeen.Journal of obstetrics and gynaecology:the journal of the Institute of Obstetrics and Gynaecology,2020

[5]陈勇.二甲双胍通过影响肌动蛋白骨架重组抑制人宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭和增殖的研究[D].贵州医科大学,2022.