BALB/3T3CLONEA31 小鼠胚胎成纤维细胞的应用

背景^[1-3]

BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞是1968年S.A.Aaronson和G.T.Todaro从裂解的14到17天的BALB/c小鼠胚胎中建立的几株细胞之一。细胞分裂对接触抑制特别敏感，生长需高倍数稀释，饱和浓度低，对癌基因DNA病毒SV40和小鼠肉瘤病毒高度易感。检测发现鼠痘病毒阴性。在免疫抑制小鼠体内不成瘤，在半固体介质中可形成集落。

BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞

BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞培养操作

1)复苏BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。

将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2)BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2 min（视细胞情况而定），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2-3ml完全培养基终止消化。轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心5 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。

c、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。

3)BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

BALB/3T3CLONEA31小鼠胚胎成纤维细胞可以用于体内外感染BALB/c小鼠HCMV分离株UL83、UL54基因遗传变异的研究

将体内外感染BALB/c小鼠人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)分离株UL83、UL54基因进行遗传变异分析,筛选影响病毒跨种属感染的相关基因,为进一步探索其机制提供线索。

方法(1)1.45×106 PFU/ml的HCMV AD169株(本室保存)、3×105PFU/ml的山东株(山东医学科学院惠赠)腹腔注射6～8周SPF级BALB/c小鼠1.0ml/只,雌雄各6只作为实验组,同时设立灭活病毒对照组和细胞对照组。一个月后取各组小鼠大脑皮质组织接种人胚胎成纤维细胞(HF)进行病毒分离与鉴定(PCR检测HCMV UL83)、RT-PCR检测大脑组织匀浆中HCMV UL54基因的转录。将从小鼠体内分离到的HCMV病毒命名为体内株(下同)。

(2) 以MOI=100的HCMVAD169株接种至BALB/c小鼠原代胚胎成纤维细胞(MF)和HF细胞,镜下逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE)并传代三次。待出现细胞病变后采用PCR和RT-PCR检测HCMV特异性基因UL83、IE基因的复制和转录。将从MF中分离到的HCMV病毒命名为体外株(下同)。山东株、临床分离株接种至HF细胞后进行传代,分别命名为山东株和临床分离株(下同)。

(3) 对各分离株提取DNA进行UL83、UL54基因全长的PCR扩增并测序,将得到的序列与其他疱疹类病毒的代表毒株以及MCMV进行比对,经MEGA 4.0软件分析绘制系统发育树。

结果：(1)1.45×106 PFU/ml的HCMV AD169株注射BALB/c小鼠,一月后取大脑皮质组织匀浆直接接种HF,实验组雌性小鼠病毒接种管出现细胞肿胀变圆,胞内颗粒增多,折光性增强。将培养物连续传代三次,仍然可观察到明显CPE。细胞培养物经PCR检测HCMV UL83基因为阳性。大脑组织匀浆直接进行HCMV UL54基因的RT-PCR检测,结果为阳性。3×105PFU/ml的山东株、灭活病毒组、HF对照组、实验组雄性小鼠,上述各项检测均为阴性。

(2) MOI=100HCMV AD169株分别接种至MF细胞和HF细胞后,可观察到MF细胞出现病毒所致CPE,与HF细胞上的CPE相似,细胞培养物均经PCR、RT-PCR检测HCMV UL83、IE基因及其转录产物,结果为阳性。

(3) 四株病毒的UL83、UL54基因序列经Clustal W软件比对分析后发现:UL83基因及其编码氨基酸序列与Genebank公布的HCMV标准株相应序列的同源性在98%～100%之间,UL54基因及其编码氨基酸序列的同源性在99%～100%之间。在发生突变的核苷酸和氨基酸位点中,体内株UL83基因的第682～684位点由CTG突变为TCT,导致第228位氨基酸发生了亮氨酸到丝氨酸的突变。经MEGA4.0软件绘制系统进化树后发现:能够适应小鼠体内环境,并感染小鼠大脑皮质的HCMV,其UL83基因在进化树上处在另一独立的支群内,其余各株的UL83基因与标准株、Merlin、Towne处于同一支群。四株病毒的UL54基因处在同一支群。结论从体内外感染HCMV的BALB/c小鼠大脑组织与原代MF中分离得到了能在小鼠大脑组织与细胞中增殖复制的HCMV毒株。

通过对各个毒株UL83、UL54基因全长的PCR扩增并测序,比对分析后发现:体内株UL83基因编码的氨基酸序列在228位发生了突变,而此位点具有诱发细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte CTL)反应的潜力。经进化关系分析后发现能够适应小鼠体内环境,并感染小鼠大脑皮质的HCMV AD169株,其UL83基因在进化树上处在另一独立的支群内。提示HCMV pp65蛋白CTL表位序列的突变可能与HCMV宿主改变有关,此项结果为进一步研究HCMV跨种属感染机制提供了线索。

参考文献

[1]Is saliva as reliable as urine for detection of cytomegalovirus DNA for neonatal screening of congenital CMV infection?.Aparecida Yulie Yamamoto;;Marisa Marcia Mussi-Pinhata;;Lauro Juliano Marin;;Rosangela Moura Brito;;Patricia Frizzo Carvalho Oliveira;;Thalita Bonadio Coelho.Journal of Clinical Virology,2006

[2]Diagnosis of Human Congenital Cytomegalovirus Infection by Amplification of Viral DNA from Dried Blood Spots on Perinatal Cards.Lori Scanga;;Shu Chaing;;Cynthia Powell;;Arthur S.Aylsworth;;Lizzie J.Harrell;;Nancy G.Henshaw;;Chris J.Civalier;;Leigh B.Thorne;;Karen Weck;;Jessica Booker;;Margaret L.Gulley.The Journal of Molecular Diagnostics,2006

[3]Retrospective Diagnosis of Congenital Cytomegalovirus Infection Using Umbilical Cord.Syuzo Ikeda;;Akira Tsuru;;Masako Moriuchi;;Hiroyuki Moriuchi.Pediatric Neurology,2006

[4]Does cytomegalovirus play a causative role in the development of various inflammatory diseases and cancer?..Journal of Internal Medicine,2006

[5]黄维.体内外感染BALB/c小鼠HCMV分离株UL83、UL54基因遗传变异的研究[D].安徽医科大学,2008.