酵母表达系统的应用

背景^[1-7]

酵母表达系统是一种最经济高效的真核蛋白表达系统，可以成功实现胞内表达或是分泌表达，且其放大培养基相对廉价，培养条件要求不高，适宜工业放大。与哺乳动物细胞表达系统一样，酵母蛋白表达系统能够对所表达蛋白进行例如糖基化、酰基化、脂基化、磷酸基化等保证蛋白天然构象的修饰，可用于制备非常接近天然蛋白的具有高附加值的蛋白原料。

酵母是从重组DNA产生蛋白质的常见宿主。它们提供相对容易的遗传操作，并在廉价培养基上快速生长至高细胞密度。作为真核生物，它们能够进行蛋白质修饰，如在真核细胞中常见的糖基化，但在细菌中相对罕见。因此，酵母可以产生与来自植物或哺乳动物的天然产物相同或非常相似的复杂蛋白质。

个酵母表达平台基于面包酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。然而在已经研究了各种酵母表达系统，并且基于它们的不同特征和能力广泛用于各种应用。例如，它们中的一些生长在广泛的碳源基上，并且不限于葡萄糖，就像面包酵母一样。其中一些也应用于基因工程和外源蛋白质的生产。各种酵母表达平台在若干特征方面不同，包括它们的生产力以及在特定实例中分泌，加工和修饰蛋白质的能力。但是，所有表达平台的使用都有一些基本的相似之处。

应用^[8]

利用酵母表达系统生产制备外源基因的表达产物已有十余年的历史,其中的S.cerevisiae表达系统和P.pastoris表达系统最受人们的青睐。截止目前,利用酵母表达系统人们已经成功地表达了多种生物(包括细菌、真菌、病毒、原生生物、植物、脊椎动物、人类)的许多蛋白质,涉及酶类、蛋白酶体、蛋白酶体抑制物、受体、单链抗体、抗原、调控蛋白等多种蛋白质。

在医学领域,酵母表达系统已经成功地应用于基因工程疫苗制备、基因工程药物制备(如抗体药物、蛋白质药物)和蛋白质功能研究等。国外,用于肌萎缩侧索硬化治疗的胰岛素样生长因子1(IGF-1)和血清代用品人血清白蛋白(HSA)已经通过了临床实验,正在等待FDA批准即可进入临床使用。

1.CoMed载体系统的设计和功能

CoMed基本载体包含用于在大肠杆菌系统中繁殖的所有大肠杆菌元件和用于整合ARS，rDNA，选择标记和表达盒模块的MCS（多克隆ste）。ARS片段的侧翼是Sac II和Bcu I限制性位点，Bcu I和Eco 47III限制性位点的rDNA区域，Eco 47III和SalI限制性位点的选择标记以及Sal I和Apa I限制性位点的启动子元件。为了产生所需产物，用载体转化合适的酵母菌株，所述载体含有用于产生目的生物产物的所有必需遗传元件。

载体还必须含有选择标记，选择标记需要从已经成功摄取过的载体中选择酵母。载体还含有某些DNA元件，允许酵母将外源DNA掺入酵母的染色体中并复制它。最重要的是，载体含有负责产生所需化合物的区段，称为表达盒。表达盒包含一系​列调节元件，用于控制最终制造某种产品的程度和程度。接下来是生物产品本身的基因。表达盒由终止子序列终止，终止子序列停止表达基因的转录。

2.常用酵母表达系统

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统、甲醇营养型酵母表达系统、裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系统。以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例,包括如下步骤:

将目的基因克隆入毕赤酵母表达载体,收获阳性重组表达质粒用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒,使之线性化将线性化的阳性重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母菌株(如GS115,KM 71)将转化物接种HIS4缺陷平板进行轮筛选用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选挑选10～20个克隆进行小规模诱导培养,鉴定外源基因的表达量，挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养,以制备外源基因的表达蛋白质。

参考文献

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