关于感受态细胞，你不可不知的那些事儿~

01

为什么DH5α生长速度慢/长斑小？

原因：

（1）DH5α感受态细胞生长速度较慢；

（2）涂板菌液太多，菌落过多，导致菌落生长速度慢/菌落小。

方案：

（1）延长菌的生长时间；

（2）建议减少菌液涂布量，剩下的菌液可放4℃保存，看菌的生长状况再决定去留。

02

DH5α和DH5α-的区别是什么？

DH5α需要IPTG和X-Gal共同使用进行蓝白斑筛选。

DH5α-无需加入IPTG，只需X-Gal即可进行蓝白斑筛选。

03

Mach1T1和Turbo哪个生长速度快？

Turbo

04

细菌怎么实现抗噬菌体的特点？

（1）抑制吸附：改变细菌表面的受体蛋白结构，受体缺失，竞争性抑制产物的作用等；

（2）阻止噬菌体DNA的注入；

（3）降解或干扰噬菌体DNA；

（4）流产感染。

05

DB3.1细胞是怎样实现含有ccdB自杀基因在细胞内扩增的？

ccdB蛋白的毒性作用是通过与促旋酶GyrA亚基第462位氨基酸相结合使得DNA断裂后不能进行修复，DNA合成受阻，导致细胞死亡。

DB3.1菌株的细胞含有gyrA462基因，能够表达GyrA亚基蛋白与ccdB结合的区域，可以竞争性抑制ccdB蛋白的活性，使得促旋酶可以正常行使功能，实现含有ccdB的载体的正常扩增。

06

从JM110细胞制备的质粒可以用于基于Dpn I消化的点突变试剂盒吗？

不能。JM110是甲基化基因dam，dcm缺失突变株，在其内扩增的质粒无法进行甲基化，而点突变试剂盒中的DpnⅠ的作用是消化甲基化的模板质粒。

注：

（1）基于DpnⅠ消化的点突试剂盒是以甲基化的载体质粒作为模板，设计一对点突引物进行扩增；

（2）使用DpnⅠ消化甲基化的模板质粒；

（3）PCR扩增的片段没有甲基化，因此不能被DpnⅠ消化降解；

（4）将DpnⅠ消化后的产物转入感受态细胞。

07

大肠杆菌质粒甲基化有哪几类？通过何种方法可以去甲基化？何种方法来验证质粒已经去甲基化？JM110可以用于大量质粒制备吗？

2种，Dam，Dcm（Dam甲基化酶可将GATC序列中的腺嘌呤N6位点进行甲基化修饰，Dcm甲基化酶可将CCAGG和CCTGG序列中胞嘧啶C5位点进行甲基化修饰）。

可以将质粒转化进入JM110感受态细胞中，实现质粒的去甲基化。

可以使用XbaⅠ酶切的方法验证质粒是否去甲基化。

不可以，JM110感受态细胞转化效率低，并且它不能使质粒甲基化，容易引起突变。

08

stbl3和stbl4的区别（菌株是从哪家公司来的）？适用于哪种类型的质粒构建？

区别：（Stbl3和Stbl4菌株是从invitrogen公司来的）Stbl3为链霉素抗性菌株，Stbl4是四环素抗性菌株。Stbl4较Stbl3生长较慢。

适用于逆转录病毒或慢病毒质粒的构建，即带有5’-LTR和3’-LTR结构的质粒，如pLV-Flag质粒。

09

蓝白斑筛选原理是什么？

（1）蓝白斑筛选的条件是具有LacZα编码区的载体与可以进行α-互补的宿主细胞（如Mach1-T1、TOP10、DH5α、JM109、DH10B和NEB10-beta等）配合使用；

（2）一些载体具有LacZα基因编码区，可以编码LacZ蛋白N端的α片段（此编码区中含有多克隆位点，允许外源基因的插入）。其宿主细胞是一种仅可以编码LacZ蛋白C端ω区域的细胞，载体和宿主单独产生的LacZ片段并没有β-半乳糖苷酶活性；

（3）当载体进入宿主细胞时，载体的α片段和宿主的ω片段实现了互补，由α-互补产生的β-半乳糖苷酶具有活性，在IPTG和X-Gal的存在下，菌落变为蓝色；

（4）但是当外源基因插入到在载体LacZα编码区中，破坏了LacZ基因α片段的正常表达，使得其与宿主细胞不能进行α-互补，因此在IPTG和X-Gal的存在下，菌落为白色。

10

DH10B和DH10Bac有何区别？

DH10B是一种可以用来进行大质粒（>8 kb）转化的克隆感受态细胞。

DH10Bac是一种用于昆虫杆状病毒Bac-to-Bac系统中同源重组所用的菌株，其可用于pFastBac系列质粒（如pFastBacl和pFastBacDual）的转化。其感受态细胞中含有用于pFastBac系列质粒重组的Bacmid和辅助质粒。

11

BL21 和BL21(DE3)的区别是什么，DE3代表什么基因？

BL21(DE3)是在BL21菌株的基因组上整合了T7 RNA聚合酶基因，适合于T7系统的表达（具有T7 promoter）。

DE3是一段可以表达T7 RNA聚合酶的序列，通过溶原性噬菌体将序列整合到细菌基因组中。

12

BL21(DE3)和T7 express表达菌有什么区别？

T7 express表达菌株来源于BL21菌株，T7 express与BL21(DE3)的主要区别在于T7 express菌株的T7 RNA聚合酶基因整合在菌株基因组中的Lac操纵子区域，并具有抗T1噬菌体感染的特点。BL21（DE3）菌株中的T7 RNA聚合酶基因来源于噬菌体溶原方法，存在噬菌体成分。

13

表达含有稀有密码子的基因需要选择哪类感受态细胞，这类细胞实现表达的原理是什么?

Rosetta（DE3）

Rosetta（DE3）具有一个带有氯霉素抗性的质粒，可以补充6种稀有密码子的tRNA（精氨酸 Arg R: AGA AGG，异亮氨酸 Ile I: AUA， 脯氨酸 Pro P CCC， 亮氨酸Leu L：CUA，甘氨酸 Gly G:GGA）。

14

使用BL21(DE3)细胞进行蛋白表达时，细胞一诱导就死，请问用什么方法解决？

可以使用BL21（DE3）pLysS 或T7pLysY表达菌株。

15

pLysY和pLysS有什么区别？

pLysY表达的T7溶菌酶保留了对T7RNA聚合酶的抑制作用，但是缺失了水解细胞壁的酰胺酶活性，避免了诱导过程中细胞的裂解。

pLysS表达的T7溶菌酶具有完整活性。

16

含有二硫键的蛋白请问用何种感受态细胞比较好？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

17

增加表达蛋白的可溶性表达采用何种感受态细胞？

OrigamiB（DE3）或Shuffle T7-K12，Shuffle T7-B。

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使用OrigamiB（DE3）感受态细胞时应该注意什么？

OrigamiB（DE3）感受态细胞具有卡那霉素和四环素抗性，所以转化的质粒不能是卡那霉素抗性或四环素抗性的。

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说明书上写这XL10-Gold细胞具有四环素和氯霉素抗性，我的质粒是氨苄青霉素抗性，请问转化这个质粒时，需要加四环素和氯霉素抗生素吗？

不用，四环素和氯霉素是在菌株的基因组中稳定存在的，不用加这两种抗生素。