MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)的应用

背景^[1-3]

MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)来源于一非洲绿猴的胚胎肾组织的上皮样细胞，从母细胞(MA-104细胞)克隆而得到，可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养，特别是2007年爆发的猪蓝耳病病毒对此细胞尤为敏感，是猪蓝耳病病毒及其防控技术研究中的重要材料。

MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)

MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)处理：

1）冻存MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮人BURKITT淋巴瘤细胞，传代可参考以下方法：

悬浮状态下生长的细胞，可以通过向培养瓶中添加完全培养基来维持细胞的生长状态，一般情况下细胞密度维持在1×105~1×10^6个/mL（不同细胞对密度要求不同，）可以维持细胞的正常生长。如需分瓶可以将细胞悬液收集到离心管中1000rpm，离心5min，弃去上清，补加1-2mL培养液后重悬混匀后将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

MARC145](非洲绿猴胚胎肾细胞)可以用于猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究

借助CRISPR/Cas9技术对Marc145细胞的基因组进行修饰和改造,构建稳定表达猪源Sn(p Sn)的Marc145细胞株(p Sn-Marc145),以期提高PRRSV的细胞吸附能力及其适应性和感染性,为PRRSV的基础与应用研究提供可靠的细胞平台支撑。

【方法】选择Marc145细胞第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子序列作为打靶区域。首先,利用生物学软件设计单向导RNA(sg RNA)并构建Cas9打靶质粒,通过软件分析和Surveyor检测试剂盒筛选脱靶效率较低的sg RNA;并利用编码增强型绿色荧光蛋白(e GFP)的供体质粒进行同源重组修复,借助荧光显微镜观察、Junction PCR、Southern Blotting等方法来确定外源基因是否可以特异性重组至靶向区域并有效表达。随后,根据所选sg RNA,构建并比较不同Cas9突变体打靶质粒的切割效率;选择脱靶效率低、切割效率和同源重组较高的Cas9打靶质粒用于p Sn-Marc145细胞的构建:在CRISPR/Cas9系统的介导下,将p Sn基因序列经供体质粒整合至Marc145细胞基因组中。嘌呤霉素加压条件下,挑取单克隆细胞并扩大培养;对经Junction PCR、Southern Blotting、Western Blotting、间接免疫荧光试验鉴定为阳性的克隆进行核型分析、细胞形态观察以及生长周期活性评估。最终,在正常的Marc145和p Sn-Marc145细胞上,比对研究制苗用PRRSV(VR2332、CH1R、R98、JXA1)和野生型PRRSV(GSWW2018和GSKL)的生物学特性。

【结果】共设计合成了5种sg RNA(sg RNA-3、-17、-23、-24、-33),其中sg RNA-24的脱靶效率最低;该打靶质粒能够将供体质粒携载的e GFP定点整合于RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子中并检测到特异性绿色荧光。3种Cas9突变体(p Sp Cas9、Cas9n、e Cas9)中,Cas9n(含双sg RNA)打靶质粒的切割效率最高;将Cas9n(含双sg RNA)打靶质粒和p Sn供体质粒转染正常的Marc145细胞后,获得了2株靶向单一整合的p Sn-Marc145重组细胞(24-15-7、24-15-9),单细胞阳性克隆在保持正常Marc145细胞遗传特征和细胞形态的同时,表现出更优的生长活性。通过蚀斑形成试验、间接免疫荧光试验、病毒生长曲线的绘制、Western Blotting和实时荧光定量PCR检测发现,尽管p Sn的表达对PRRSV疫苗生产用毒种在Marc145细胞中的毒力和复制能力影响不大,但显著提高高致病性PRRSV(HR-PRRSV,JXA1)的吸附能力;通过传代培养、遗传变异分析、实时荧光定量PCR、蚀斑形成试验和病毒生长曲线的绘制发现,2株野生型PRRSV在p Sn-Marc145细胞上具有明显强于其在正常Marc145细胞上的适应性和感染性。

【结论】综上所述研究结果表明:一、Marc145细胞基因组中第11号染色体RACGAP1和ASIC1基因之间的内含子区域可作为外源基因定点打靶的有效位点。

二、利用CRISPR/Cas9系统构建的p Sn-Marc145细胞株在HP-PRRSV疫苗生产和野生型PRRSV分离过程中具有良好的应用潜力。

参考文献

[1]CRISPR–Cas9 in genome editing:Its function and medical applications[J].Saedeh Khadempar;;Shokoufeh Familghadakchi;;Roozbeh Akbari Motlagh;;Najmeh Farahani;;Maryam Dashtiahangar;;Hamzeh Rezaei;;Seyed Mohammad Gheibi Hayat.Journal of Cellular Physiology,2019(5)

[2]Structure Studies of the CRISPR-Csm Complex Reveal Mechanism of Co-transcriptional Interference[J].Lilan You;;Jun Ma;;Jiuyu Wang;;Daria Artamonova;;Min Wang;;Liang Liu;;Hua Xiang;;Konstantin Severinov;;Xinzheng Zhang;;Yanli Wang.Cell,2018

[3]Quantitative assessment of HR and NHEJ activities via CRISPR/Cas9-induced oligodeoxynucleotide-mediated DSB repair[J].Jie Du;;Narui Yin;;Ting Xie;;Yunfeng Zheng;;Ning Xia;;Jun Shang;;Fei Chen;;Haowen Zhang;;Jiahua Yu;;Fenju Liu.DNA Repair,2018

[4]Siglecs:A journey through the evolution of sialic acid-binding immunoglobulin-type lectins[J].Kim F.Bornh?fft;;Tom Goldammer;;Alexander Rebl;;Sebastian P.Galuska.Developmental and Comparative Immunology,2018

[5]常艳燕.猪源唾液酸黏附素介导PRRS病毒感染Marc145细胞的适应性研究[D].甘肃农业大学,2020.