食品新资源探索:通过合成酵母细胞工厂从甲醇中高效地生产3-羟基丙酸

Efficient Bioproduction of 3-Hydroxypropionic Acid from Methanol by a Synthetic Yeast Cell Factory

ACS Sustainable Chemistry & Engineering (IF: 9.224）

导读

基于可再生资源的微生物生物制造是一种独立于石油化工资源的可持续生产模式。3-羟基丙酸（3-HP）可以聚合成聚3-HP或加入到共聚物中，如聚羟基烷烃（PHA）。这些材料是可生物降解和生物相容的，并具有优良的机械性能。3-HP 可用作食品添加剂和药物制造，如饮料、罐头、果脯、抗癌药物、治疗消化道疾病药物。3-HP的生物合成可以通过三种途径实现：甘油途径、丙二酰-CoA途径，或β-丙氨酸途径。在这些途径中，丙二酰-CoA途径由于其热力学可行性、前体的可用性和不需要辅助因子维生素B12而具有吸引力。该途径的关键酶，丙二酰-CoA还原酶（Mcr），拥有两个活性域，其中C端（Mcr-C）催化丙二酰-CoA还原成丙二酸半醛（MSA），N端（Mcr-N）催化MSA进一步还原成3-HP。大肠杆菌和酿酒酵母，已应用于丙二酰-CoA途径生产3-HP。代谢工程和合成生物学的出现使促进细胞代谢的广泛重构成为可能，引起细胞3-HP的性能显著提高。然而，在生产中普遍使用糖类作为底物，引起了人们对食品供应与耕地之间的潜在竞争的担忧。碳中和的目标促使我们探索可再生的一碳（C1）原料进行化学生产的替代生物工艺。C1原料，如一氧化碳、二氧化碳、甲烷和甲醇，是一类廉价和广泛使用的底物，可减少温室气体排放。甲醇具有液体特性和高还原潜力，是一种有前途的发酵底物。

最近，通过工程化的甲醇途径，利用甲基营养细菌Methylorubrum extorquens来生产3-HP， 将3-HP产量从69 mg/L提高到了91 mg/L。此外，高效的遗传工具可以重新调整细胞代谢，使之向化学过量生产发展。尽管有这些优势，由于甲醇代谢的复杂性，利用甲醇的碳通量导向化学生物合成仍然具有挑战性。

本研究中，我们通过优化丙二酰-CoA途径、加强前体和辅助因子的供应以及提高甲醇利用率等代谢工程策略，对P.pastoris（毕赤酵母）进行了改造，使其能够从单一的甲醇中过量生产3-HP。特别是，通过代谢改造一个游离脂肪酸（FFA）过剩的菌株，使其在摇瓶中高产1.9 g/L的3-HP。进一步降低甲醇异化作用，将3-HP产量提高到2.2 g/L，并在生物反应器中实现了48.2 g/L的高产。这是使用甲醇作为唯一的碳源生产3-HP的最高产量，表明P.pastoris具有用于甲醇生物转化的巨大潜力。

研究内容

本研究首先优化3-HP合成酶基因MCR的表达，加强前体和NADPH的供应。接着，使用甲醇作为唯一碳源进行生产3-HP的摇瓶批量发酵。进一步下调甲醇异化作用，在生物反应器中进行喂养批次培养，提高3-HP的产量，开发了一个高效的P.pastoris细胞工厂，用于3-HP的过度生产，实现了以甲醇为唯一碳源高效合成3-羟基丙酸（3-HP），发酵罐产量达48.2 g/L。该研究显示了毕赤酵母在甲醇生物转化中的巨大潜力。

研究结论

本研究设计了一种工业酵母P.pastoris，通过使用丙二酰-CoA衍生的途径，让甲醇作为唯一的碳源有效地生产3-HP。同时优化来自Chloroflexus aurantiacus的丙二酰-CoA还原酶基因MCR的表达，加强前体和NADPH的供应，使3-HP的产量达到1.5 g/L。为了避免耗时的基因操作，通过代谢将过度生产FFA的菌株向3-HP生物合成转化，使3-HP在摇瓶中的产量达到1.9 g/L。接着进一步下调甲醇异化作用，3-HP的产量被提高到2.2 g/L。随后在生物反应器中批次培养，从最小的培养基中得到了48.2 g/L的3-HP，产量为0.23 g/g甲醇。值得注意的是，这是从C1原料中生产3-HP的最高产量，并且与从酵母中的糖中生产的3-HP相当。从甲醇中生产高水平的3-HP突出了P. pastoris作为甲醇生物转化的潜力。此外，本研究提出的策略可用于在P.pastoris中从甲醇生产其他乙酰-CoA衍生物。

创新点

（1）甲醇的液体特性和高还原潜力被认为是一种有前途的发酵底物。

（2）进一步降低甲醇异化作用，并在生物反应器中实现了高水平生产。

（3）开发了一个高效的P.pastoris细胞工厂，用于3-HP的大量生产。

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附图：

图1. 优化MCR的表达。左边代表MCR的表达方式（线表示染色体整合，圆圈表示外显体质粒表达），右边是3-HP的滴度和细胞密度。

图2. 3-HP生产的中心代谢工程。(A) 3-HP生物合成的新陈代谢网络方案。(B) 过度表达供应前体乙酰CoA和丙二酰CoA的基因。(C) 过度表达供应NADPH的基因。(D) 过度表达与甲醇代谢有关的基因以生产3-HP。所有数据均以三个样本的平均值±SD表示。与对照组（XY45）相比，不同的3-HP水平的统计学意义用学生t检验来评估（*，P < 0.05；**，P < 0.01）。

图3. 生产FFA的菌株在3-HP生产过程中的代谢转化。(A）FFA生物合成向3-HP生产的代谢转化示意图。(B) 从野生型菌株和FFA过量生产的工程菌株中的3-HP滴度和细胞密度。

图4. 甲醇异化途径的下调。(A）甲醇同化途径和异化途径的示意图。下调的基因以绿色标记。(B) 在菌株FXY03中通过启动子替换下调FLD1或FDH1后，3-HP的滴度和菌株的细胞密度。(C) 在菌株FXY04中通过启动子替换下调FLD1后，3-HP的滴度和菌株的细胞密度。所有数据均为三个独立样本的平均值±SD。与对照组（FXY04）相比，不同的3-HP水平的统计学意义用学生的t检验来评估（*，P < 0.05；**，P < 0.01）。

图5. 最终工程菌株FXY17H批量发酵生产3-HP。在摇瓶（A）或1 L生物反应器（B）中进行批量发酵。FXY17H是一个原型菌株，在FXY17中补充了HIS4标记。显示了3-HP滴度（蓝色）、生长曲线（空心灰圈）、甲醇浓度或甲醇消耗量（空心灰方）的时间过程。误差条代表一式三份样本的SD。

原文链接

https://doi.org/10.1021/acssuschemeng.3c00410