人胰腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人胰腺癌细胞是胰腺管腺癌细胞系，建自26岁白人男性囊性纤维变性(CF)的肝转移灶。CFPAC-1细胞表达囊性纤维变性跨膜调节因子(CFTR)，CFPAC-1细胞形态为上皮细胞样且顶端微绒毛极化。CFPAC-1细胞表达胰腺管细胞特征性的细胞角蛋白和癌胚抗原，倍增时间为30-32小时。CFPAC-1细胞是亚3倍体的细胞系，36％的细胞的染色体模式数为75。CFPAC-1细胞传代至24代时，可在免疫抑制小鼠中致瘤。

人胰腺癌细胞

人胰腺癌细胞培养步骤

一、复苏人胰腺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

二、人胰腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于贴壁人胰腺癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、人胰腺癌细胞冻存：

1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；

4、先将细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃

应用^[4][5]

人胰腺癌细胞可以用于下调RBBP4蛋白抑制人胰腺癌细胞的增殖及机制研究

RBBP4在人肺癌、胃肠癌和宫颈癌等肿瘤细胞中呈过表达,下调RBBP4能有效抑制这些肿瘤细胞的增殖,显示其有望成为抗肿瘤的新靶点。鉴于以上事实,本课题以RBBP4为切入点,为治疗胰腺癌探寻新的途径。

方法:以免疫组化法检测人胰腺癌和癌旁组织中RBBP4的表达;RNAi技术下调目的蛋白表达;MTT和平板克隆法检测细胞的增殖;流式细胞术检测细胞周期;β-半乳糖苷酶法检测细胞衰老情况;Western Blot法检测蛋白表达;慢病毒载体构建过表达RBBP4、Cyclin D1和CDC25C的细胞株。

结果:在71例人胰腺癌组织样本中,有51例(71.83%)RBBP4表达呈中-强阳性,癌旁组织样本中仅26例(36.62%)呈中-强阳性,二者有显著差异(P<0.001);

以siRBBP4下调RBBP4的表达后,人胰腺癌细胞株Panc-1,Bxpc-3,Aspc-1的存活率分别下降为65.16±3.04%,75.98±3.89%,75.38±6.84%(P<0.01);细胞克隆数为25.33±3.51,87.00±3.65,45.75±7.76,明显少于对照组的56.67±4.04,197.25±8.02,117.25±10.5(P<0.01)。

下调RBBP4表达后,吉西他滨对Panc-1,Bxpc-3,Aspc-1细胞的IC50值分别从56.90±1.19 nM降为5.18±1.31 nM(P<0.001),0.044±0.012 nM降为0.012±0.003 nM(P<0.001),2.36±1.18 nM降为0.38±0.14 nM(P<0.001);顺铂的IC50值分别从8.54±0.52μg/mL降为4.09±0.69μg/mL(P<0.001),1.10±0.06μg/mL降为0.22±0.11μg/mL(P<0.001),20.40±2.12μg/mL降为11.85±2.40μg/mL(P<0.001)。

下调RBBP4表达,Panc-1,Bxpc-3,Aspc-1细胞G2/M期比例分别从22.31±0.54%升为39.31±4.69%(P<0.01),19.85±2.10%升为27.22±3.33%(P<0.05),10.85±2.32%升为18.07±1.24%(P<0.05)。β-半乳糖苷酶染色显示下调RBBP4表达后细胞呈衰老状态。机制研究发现siRBBP4作用2天,Panc-1细胞中Cyclin D1和CDC25C蛋白表达量下调为基础量的29.2±1.42%和34.8±1.29%(P<0.001),Bxpc-3细胞中为88.5±3.83%和76.9±4.10%(P<0.01),Aspc-1细胞中为85.8±2.11%和65.7±3.82%(P<0.01)。为进一部阐明Cyclin D1和CDC25C在siRBBP4抑制胰腺癌增殖中的作用,我们构建分别过表达Cyclin D1和CDC25C的胰腺癌细胞株,结果显示过表达Cyclin D1可部分拮抗siRBBP4对细胞的抑制作用,而过表达CDC25C能显著拮抗siRBBP4的抑制作用。

结论:约70%人胰腺癌病例中RBBP4呈现过表达,下调RBBP4表达可诱导人胰腺癌细胞发生G2/M期阻滞,促使细胞衰老,抑制细胞增殖,增加胰腺癌细胞对吉西他滨和顺铂的敏感性。其作用主要是通过抑制细胞CDC25C的表达实现的。

参考文献

[1]Breast cancer targeted/therapeutic with double and triple fusion Immunotoxins[J].Zoleikha Goleij;;Hamideh Mahmoodzadeh Hosseini;;Hamid Sedighian;;Elham Behzadi;;Raheleh Halabian;;Rahim Sorouri;;Abbas Ali Imani Fooladi.Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2020(prep)

[2]Developing effective combination therapy for pancreatic cancer:An overview[J].Aubrey L.Miller;;Patrick L.Garcia;;Karina J.Yoon.Pharmacological Research,2020(prep)

[3]Cell cycle regulators in cancer cell metabolism[J].Lucia C.Leal-Esteban;;Lluis Fajas.BBA-Molecular Basis of Disease,2020(5)

[4]Engaging chromatin:PRC2 structure meets function.[J].Chammas Paul;;Mocavini Ivano;;Di Croce Luciano.British journal of cancer,2020(3)

[5]陈智如.下调RBBP4蛋白抑制人胰腺癌细胞的增殖及机制研究[D].南方医科大学,2020.