人微血管内皮细胞株的应用

背景^[1-3]

人微血管内皮细胞株是从人包皮中分离的微血管内皮细胞用pSVT载体转染，PSvt载体是一种基于pBR-322的质粒，含有猿猴病毒40A基因产物大T抗原的编码区。CRL-3243，HMEC-1，已被很好地表征，并显示保留了内皮细胞的许多特征。这些永生化细胞，因为它们是人类微血管内皮细胞的持续可再生来源，可以在许多研究中用作原代人皮肤内皮细胞的替代物。

人微血管内皮细胞株

人微血管内皮细胞株细胞复苏、传代及冻存流程参考：

1、人微血管内皮细胞株细胞复苏

1）配制完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、人微血管内皮细胞株细胞传代

1）待细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人微血管内皮细胞株细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

应用^[4][5]

人微血管内皮细胞株可以用于促甲状腺激素抑制人微血管内皮细胞一氧化氮合酶的机制研究

通过检测TSH干预人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells,HMEC-1)后细胞内eNOS及P-AKT、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(phosphor-extracellular signal regulated kinase,P-ERK)含量的变化,探讨TSH对eNOS的调控作用及其主要信号通路,深入了解TSH对血管内皮功能的调节机制。

方法:体外培养HMEC-1细胞,提取细胞总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)法检测HMEC-1促甲状腺激素受体(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)mRNA的表达,验证HMEC-1细胞表达TSHR;分别以不同浓度TSH(0,10,100mIU/ml)干预HMEC-1 24h,应用荧光定量PCR法检测e NOS mRNA的表达水平,应用Western blot法检测eNOS的蛋白表达水平,观察TSH对内皮细胞eNOS的调节作用。

分别以不同浓度TSH(0,10,100mIU/ml)干预HMEC-1 24h,提取细胞总蛋白,应用Western Blot法检测总AKT、总细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)及其磷酸化蛋白的水平。以磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)抑制剂LY294002、ERK抑制剂PD98059预处理细胞,分别阻断TSH诱导的AKT和ERK的活化,再加入100mIU/ml TSH干预细胞,培养24h后,提取各组细胞总蛋白,应用Western Blot法检测eNOS、P-AKT、AKT、P-ERK、ERK蛋白水平,探讨TSH调节HMEC-1 eNOS的机制。

结果:(1)HMEC-1细胞表达TSHR。

(2) 以不同浓度的TSH干预HMEC-1,TSH呈剂量依赖性显著抑制eNOS的表达,且TSH呈剂量依赖性显著促进P-AKT、P-ERK的表达。

(3)应用PI3K抑制剂LY294002、ERK抑制剂PD98059预处理HMEC-1将AKT、ERK通路阻断后TSH对HMEC-1 eNOS的抑制作用显著减弱。结论:TSH可能通过PI3K/AKT、ERK信号通路抑制HMEC-1eNOS的表达。

参考文献

[1]Protective Role of Perivascular Adipose Tissue in Endothelial Dysfunction and Insulin-Induced Vasodilatation of Hypercholesterolemic LDL Receptor-Deficient Mice[J].Natali Baltieri;;Daniele M.Guizoni;;Jamaira A.Victorio;;Ana P.Davel.Frontiers in Physiology,2018

[2]Inducible nitric oxide synthase:Good or bad?[J].Maggie Lind;;Alan Hayes;;Martin Caprnda;;Daniel Petrovic;;Luis Rodrigo;;Peter Kruzliak;;Anthony Zulli.Biomedicine&Pharmacotherapy,2017

[3]Role of ERK1/2 activation and nNOS uncoupling on endothelial dysfunction induced by lysophosphatidylcholine[J].Gianne P.Campos-Mota;;Juliana M.Navia-Pelaez;;Jessica Cristina Araujo-Souza;;Nikos Stergiopulos;;Luciano S.A.Capettini.Atherosclerosis,2017

[4]Mechanisms Explaining the Influence of Subclinical Hypothyroidism on the Onset and Progression of Chronic Heart Failure[J].Vincenzo Triggiani;;Vito Angelo Giagulli;;Giovanni De Pergola;;Brunella Licchelli;;Edoardo Guastamacchia;;Massimo Iacoviello.Endocrine,Metabolic&Immune Disorders-Drug Targ,2016(1)

[5]时敏敏.促甲状腺激素抑制人微血管内皮细胞一氧化氮合酶的机制研究[D].济宁医学院,2018.