Ac-IETD-pNA (Caspase 8显色底物)

背景^[1-7]

Ac-IETD-pNA(Caspase 8显色底物)Ac-VEID-pNA(Caspase 8显色底物)是采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 8酶活性或纯化的caspase 8酶活性的显色底物。

原理:caspase 8可以催化底物Ac-VEID-pNA(acetyl-Val-Glu-Ilel-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。Caspase-8是一种caspase蛋白，由CASP8基因编码。它很可能作用于caspase-3。已经在许多哺乳动物中鉴定了CASP8直向同源物，其中可获得完整的基因组数据。这些独特的直向同源物也存在于鸟类中。CASP8基因编码的成员半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（胱天蛋白酶）家族。半胱氨酸蛋白酶的顺序激活在细胞凋亡的执行阶段起着重要作用。

半胱天冬酶作为无活性酶原存在，其由前结构域，大蛋白酶亚基和小蛋白酶亚基组成。半胱天冬酶的激活需要在保守的内部天冬氨酸残基处进行蛋白水解加工，以产生由大小亚基组成的异二聚体酶。这种蛋白质参与由...诱导的程序性细胞死亡Fas和各种凋亡刺激。该蛋白的N末端FADD样死亡效应结构域表明它可能与Fas相互作用蛋白FADD相互作用。

在来自亨廷顿病患者的受影响脑区域的不溶性部分中检测到该蛋白质，但在来自正常对照的那些中检测不到，这暗示了神经退行性疾病中的作用。已经描述了编码不同同种型的许多可变剪接的转录物变体，尽管并非所有变体都具有确定的全长序列。非常罕见的免疫系统遗传疾病也可能由该基因的突变引起。这种疾病称为CEDS，代表“Caspase 8缺乏状态。”

CEDS具有与ALPS相似的特征，ALPS是另一种凋亡遗传疾病，具有免疫缺陷表型。因此，临床表现包括脾肿大和淋巴结肿大，以及复发性肺窦感染，复发性粘膜皮肤疱疹病毒，持续性疣和传染性软疣感染以及低丙种球蛋白血症。实质上有时存在淋巴细胞浸润性疾病器官，但自身免疫性最小，并且在CEDS患者中未观察到淋巴瘤。CEDS以常染色体隐性方式遗传。

caspase-8被认为主要是促凋亡蛋白酶，其主要参与来自肿瘤坏死因子受体家族死亡受体如Fas的信号转导。淋巴细胞活化和保护性免疫的缺陷表明caspase-8在淋巴细胞中具有额外的信号传导作用。

进一步的研究表明，caspase-8对T，B和自然杀伤细胞中抗原受体，Fc受体或Toll样受体4刺激后诱导转录因子“核因子κB”（NF-κB）至关重要。在生物化学上，发现caspase-8与上游Bcl10-MALT1（粘膜相关淋巴组织）衔接子复合物进入NF-κB激酶抑制剂（IKK）的复合物，这对于诱导NF-κB核转位至关重要。。此外，caspase-8的生化形式在两种途径中不同。对于死亡途径，caspase-8酶原被切割成亚基，其组装形成成熟的，高活性的半胱天冬酶异四聚体，而对于激活途径，酶原似乎保持完整，可能限制其蛋白水解功能但增强其作为衔接子的能力蛋白。

研究应用^[8]

Ac-IETD-pNA (Caspase 8显色底物)可用于研究Caspase8在实验性神经母细胞瘤细胞凋亡中作用的研究。

Caspase8表达对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapop-tosisinducingligand,TRAIL)诱导神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)细胞株SH-SY5Y(SY5Y)细胞凋亡的影响及其发生机制。方法应用RT-PCR方法和免疫组化法检测IFNγ作用前后SY5Y细胞Caspase8的表达;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及流式细胞仪(FCM)检测IFNγ、TRAIL、IFNγ+TRAIL及IFNγ+Cas-pase8抑制剂+TRAIL对SY5Y细胞生长及凋亡的影响。

结果SY5Y细胞不表达Caspase8,IFNγ作用48h后的SY5Y细胞Caspase8表达明显增加;SY5Y细胞对TRAIL不敏感,经IFNγ诱导表达Caspase8的SY5Y细胞对TRAIL敏感,且与TRAIL浓度有关,Caspase8抑制剂可明显降低TRAIL对表达Caspase8的SY5Y细胞的杀伤作用。结论IFNγ通过诱导Caspase8表达而逆转SY5Y细胞对TRAIL诱导凋亡的耐受。

参考文献

[1]Chun HJ,Zheng L,Ahmad M,Wang J,Speirs CK,Siegel RM,Dale JK,Puck J,Davis J,Hall CG,Skoda-Smith S,Atkinson TP,Straus SE,Lenardo MJ(2002)."Pleiotropic defects in lymphocyte activation caused by caspase-8 mutations lead to human immunodeficiency".Nature.419(6905):395–9.doi:10.1038/nature01063.PMID 12353035.

[2]Ng FW,Nguyen M,Kwan T,Branton PE,Nicholson DW,Cromlish JA,Shore GC(October 1997)."p28 Bap31,a Bcl-2/Bcl-XL-and procaspase-8-associated protein in the endoplasmic reticulum".J.Cell Biol.139(2):327–38.

[3]Gajate C,Mollinedo F(March 2005)."Cytoskeleton-mediated death receptor and ligand concentration in lipid rafts forms apoptosis-promoting clusters in cancer chemotherapy".J.Biol.Chem.280(12):11641–7.

[4]Guo Y,Srinivasula SM,Druilhe A,Fernandes-Alnemri T,Alnemri ES(April 2002)."Caspase-2 induces apoptosis by releasing proapoptotic proteins from mitochondria".J.Biol.Chem.277(16):13430–7.

[4]Poulaki V,Mitsiades N,Romero ME,Tsokos M(June 2001)."Fas-mediated apoptosis in neuroblastoma requires mitochondrial activation and is inhibited by FLICE inhibitor protein and Bcl-2".Cancer Res.61(12):4864–72.PMID 11406564.

[5]Micheau O,Tschopp J(July 2003)."Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two sequential signaling complexes".Cell.114(2):181–90.

[6]Shu HB,Halpin DR,Goeddel DV(June 1997)."Casper is a FADD-and caspase-related inducer of apoptosis".Immunity.6(6):751–63.

[7]Goltsev YV,Kovalenko AV,Arnold E,Varfolomeev EE,Brodianskii VM,Wallach D(August 1997)."CASH,a novel caspase homologue with death effector domains".J.Biol.Chem.272(32):19641–4.

[8]张继红,佟海侠,滕绍春,张可仞,张锦华.Caspase8在实验性神经母细胞瘤细胞凋亡中作用的研究(英文)[J].中国现代医学杂志,2006(13):1921-1925.