人肝癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肝癌细胞是一株人肝癌细胞株，这株细胞建立于裸鼠体外移植瘤。

人肝癌细胞特性：

1）来源：人，男性，45岁，肝，肝癌

2）形态：上皮细胞样，贴壁生长

3）培养条件：RPMI-1640培养基+10%优质胎牛血清+1%双抗；空气，95%；二氧化碳：5%；37℃。

人肝癌细胞

人肝癌细胞复苏、传代及冻存流程：

1、人肝癌细胞复苏

1）配制人肝癌细胞完全培养基：基础培养基+胎牛血清+双抗（特殊培养基特殊配置）；

2）人肝癌细胞复苏：取5ml完全培养基于15ml离心管中，37℃水浴锅预热，从液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出冻存的细胞，放入37℃水浴锅中，摇晃使快速化冻（1min左右），然后将化冻的细胞和预热的培养基，移入超净工作台中，化冻的细胞加入到含预热培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）吸弃上清，得到细胞沉淀，用2ml完全培养基轻轻重悬细胞，加入到T25培养瓶中，做好标记，放入37℃，5%CO2饱和适度培养箱中培养（培养皿复苏效果更好）；

4）24h后，观察细胞贴壁情况（未贴壁的即为死细胞--针对贴壁细胞），吸弃旧培养基，加入新鲜的预热（室温或37℃）的完全培养基，继续培养。

2、人肝癌细胞传代

1）待人肝癌细胞生长到80%-90%汇合度时，吸弃旧的培养基，加入1ml无菌PBS润洗一次，以去除残余的培养基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培养箱中消化（1~2min左右，不同细胞消化时间不同），取出细胞，镜下观察细胞至细胞皱缩变圆；

2）加入1ml完全培养基（含FBS）终止消化，轻轻拍打，使细胞脱落下来成单个细胞悬液，收集细胞于15ml无菌离心管中，1000rpm，离心5min；

3）收集人肝癌细胞沉淀，完全培养基重悬，一分为二（可根据细胞生长速度调整比例），分别加入到2个新的培养瓶中，做好标记，放入培养箱中培养。

3、人肝癌细胞冻存

1）按照细胞传代方法，在超净工作台内消化收集细胞沉淀，取少量细胞用于计数；

2）用预冷的1ml冻存液（90%完全培养基+10%DMSO）或者无血清细胞冻存液重悬细胞，加入到1.2ml冻存管中，密度为1*106个/ml。

3）放入程序冻存盒，-80℃过夜后，转入液氮长期保存。

应用^[4][5]

人肝癌细胞可以用于人类肝细胞性肝癌细胞系Hep G2和Li-7在裸鼠体内成瘤研究及其血清蛋白谱分析

将人类肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)细胞系Hep G2和Li-7的细胞悬液,分别接种在BALB/c A-nu裸鼠(雌性,4周龄)的左上肢背侧皮下,以研究其在裸鼠体内的致瘤作用。采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS),在不同的时间点分析裸鼠体内微量蛋白质的变化,以筛选与肝癌相关的微量蛋白标志物。

方法:购买商品化的Hep G2和Li-7细胞系,在大量传代培养之后,选择处于对数生长期的细胞,采用RPMI-1640细胞培养基将其配制成一定浓度的细胞悬液,并以一定的剂量接种在裸鼠的左上肢背侧皮下。对照组在相同的部位接种同等剂量的RPMI-1640细胞培养基。

观察裸鼠的生长情况,每周定时称量裸鼠体重。裸鼠取血采用摘眼球取血法。对于注射Hep G2细胞的裸鼠,分别在注射后的第20天,第40天和第60天的三个时间点取血,每个时间点均包括一组对照组和一组实验组裸鼠。对于注射Li-7细胞的裸鼠,在注射后的第40天取血。待所取得的血液凝固后,在常温下离心6分钟,转速为6000 rpm(Revolutions Per Minute,转/分钟)。将获得的血清分装在新的ep管中,并立即冻存在超低温(-80℃)冰箱。待裸鼠死亡之后,取出重要脏器肝,肺,肾,胃做病理检查。

采用SELDI-TOF-MS分析血清中的蛋白谱变化,利用质谱仪系统自带分析软件(Ciphergen Protein Chip 3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1)和统计学分析软件SPSS 16.0对所取得的数据进行分析,从而筛选出具有差异性的蛋白。结果:(1)两种人类HCC细胞系在裸鼠体内均未形成瘤块。注射Hep G2细胞的裸鼠解剖未发现脏器异常,注射Li-7细胞的裸鼠,其肝脏出现水肿,胃出现灶性粘膜肠化的现象;

(2) 注射Hep G2细胞的裸鼠,对照组裸鼠在生长过程中的不同时间点间出现了9个差异微量蛋白,其中上调的有3个,质荷比(Mass-to-Charge Ratio,M/Z)分别为4014.16、4122.70和8373.05,下调的有3个,M/Z分别为1264.62、1491.80和22582.5。实验组裸鼠在生长过程中的不同时间点间出现了29个差异蛋白,其中上调的有5个,M/Z分别为3701.15、4560.87、8169.14、8258.08和12047.4,下调的有3个,M/Z分别为1025.35、1045.15和4319.54,这些具有规律性变化的微量蛋白质在对照裸鼠体内均未发现。对照组和实验组裸鼠在生长过程中同时出现的差异蛋白有4个,M/Z分别1264.62、1491.80、4014.16和8373.05,其中,4014.16和8373.05在对照组中上调,1264.62和1491.80在对照组中下调,而这4个蛋白在实验组中没有规律性变化。

(3) 注射Li-7细胞的裸鼠,对照组和实验组出现了12个差异性微量蛋白,M/Z分别为1027.39、1087.44、1179.59、1192.62、1483.17、1563.20、3763.00、3869.26、4319.54、6646.16、8793.72和9259.75。

结论:1.人类HCC细胞系Hep G2和Li-7在裸鼠体内不致瘤。并不是每一种肝癌细胞系在裸鼠体内都可以复制出模型。

2. 采用SELDI-TOF-MS分析血清的蛋白变化,筛选具有差异的蛋白,可以为肝癌的诊断和研究提供新思路。

3.不同肝癌细胞系在裸鼠体内所产生的的微量蛋白种类和数量不同,提示不同细胞系的肝癌应具有不同的微量蛋白标志物。

参考文献

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[5]曾小峻.人类肝细胞性肝癌细胞系Hep G2和Li-7在裸鼠体内成瘤研究及其血清蛋白谱分析[D].四川医科大学,2015.