人子宫颈表皮癌细胞的应用

背景^[1-3]

人子宫颈表皮癌细胞来源于一个细胞集落不规则没有显著角质化的侵染性鳞状细胞癌。单层培养的细胞间可以观察到带状连接，也注意到有细胞质张力丝。1970年发现支原体污染并去除。肿瘤坏死因子(TNF)α抑制ME-180的生长。这株细胞含有人乳头瘤病毒(HPV)DNA，与HPV-39的同源性高于HPV-18。

人子宫颈表皮癌细胞

人子宫颈表皮癌细胞培养操作：

1)复苏人子宫颈表皮癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主

将含有1 mL人子宫颈表皮癌细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第三天换液并检查细胞密度。

2)人子宫颈表皮癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将人子宫颈表皮癌细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)人子宫颈表皮癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集人子宫颈表皮癌细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据人子宫颈表皮癌细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人子宫颈表皮癌细胞可以用于HPV16E6基因过表达载体构建及对Me180细胞侵袭与迁移的影响

构建HPV16E6过表达腺病毒载体,比较HPV16E6过表达组和空白载体组两组与空白对照组Me180细胞侵袭与迁移能力的大小,以及E-cadherin m RNA、蛋白的表达及其启动子甲基化的状态,探究HPV16E6对宫颈癌Me180细胞侵袭与迁移能力的影响及其机制。

方法:1.构建HPV16E6腺病毒:将HPV16E6基因亚克隆至腺病毒穿梭质粒p HBAd-MCMV-GFP,用Eco R I和Bam H I双酶切判定、运用PCR技术扩增并将其产物与p HBAd-MCMV-GFP结合并转化大肠杆菌,检测序列是否正确,然后取HPV16E6过表达腺病毒载体质粒及骨架质粒,用Lipofiter TM转染试剂介导将重组体腺病毒在293A细胞中的包装扩增纯化;

2. 病毒转染效果验证:将过表达HPV16E6腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞,空白腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞,以及未进行腺病毒转染的宫颈癌Me180细胞分成3组:HPV16E6过表达组、空白载体组以及空白对照组,用过表达HPV16E6基因的腺病毒及其空白腺病毒载体感染Me180细胞,36小时后观察绿色荧光表达情况,观察荧光效果并运用Western-Blot实验检测3组细胞中HPV16E6的表达来验证其转染效果;

3. 细胞迁移与侵袭能力:运用Traswell迁移与侵袭实验检测过表达HPV16E6基因对宫颈癌Me180细胞系迁移与侵袭能力的影响;

4. 机制研究:运用RT-q PCR实验及Western-Blot实验检测3组细胞中E-cadherin m RNA及其蛋白的表达,分析HPV16E6基因对Me180细胞迁移与侵袭能力影响的机制,并进一步运用甲基化特异性PCR检测三组细胞E-cadherin甲基化状态进行验证。

结果:1.通过琼脂糖凝胶电泳试验、测序结果证实了携带HPV16E6序列穿梭载体构建成功,荧光显微镜图片及Western blot结果显示过表达HPV16E6的腺病毒已成功转染至宫颈癌Me180细胞中,转染效率高(80%-90%);

2. Transwell迁移与侵袭实验中,过表达HPV16E6腺病毒转染宫颈癌Me180细胞后,同空白对照组相比较其细胞的迁移与侵袭能力显著增强(P<0.05),而空白载体组相对空白对照组,其细胞的侵袭与迁移能力无明显改变(P>0.05);

3.RT-q PCR及Western-Blot实验中,过表达HPV16E6组同空白对照组相比较,其E-cadherin m RNA及其蛋白的表达呈显著下降(P<0.05),而空白载体组的与空白对照组相比较,其E-cadherin m RNA及其蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);

4.甲基化特异性PCR显示,过表达HPV16E6组的细胞E-cadherin启动子区呈完全甲基化状态,其甲基化程度明显高于空白对照组(P<0.05),而空白载体组甲基化程度与空白对照组相比较,无明显差异性(P>0.05)。

结论:1..HPV16E6基因可能通过下调宫颈癌细胞系Me180中E-cadherin的表达水平增强宫颈癌细胞系Me180细胞迁移与侵袭能力,进而促进癌细胞的侵袭与转移;

2.表观遗传学方面,HPV16E6基因可通过上调E-cadherin启动子区甲基化水平从而抑制E-cadherin蛋白表达,可能是逆转宫颈癌侵袭与转移的潜在关键点。

参考文献

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[2]Molecular targets of HEPV oncoproteins:Potential biomarkers for cervical carcinogenesis[J].Antonio Carlos de Freitas;;Eliane Campos Coimbra;;Maria da Concei??o Gomes Leit?o.BBA-Reviews on Cancer,2014(2)

[3]PinX1,a novel target gene of p53,is suppressed by HPV16 E6 in cervical cancer cells[J].Gengze Wu;;Dongbo Liu;;Ke Jiang;;Li Zhang;;Yijun Zeng;;Peng Zhou;;Dan Zhong;;Min Gao;;Fengtian He;;Yingru Zheng.BBA-Gene Regulatory Mechanisms,2014(2)

[4]Plasmid-based E6-specific siRNA and co-expression of wild-type p53 suppresses the growth of cervical cancer in vitro and in vivo[J].Xin Li;;Yang Li;;Jiadi Hu;;Bo Wang;;Lijing Zhao;;Kun Ji;;Baofeng Guo;;Di Yin;;Yanwei Du;;Dennis J.Kopecko;;Dhananjaya V.Kalvakolanu;;Xuejian Zhao;;Deqi Xu;;Ling Zhang.Cancer Letters,2013(1)

[5]魏朝朝.HPV16E6基因过表达载体构建及对Me180细胞侵袭与迁移的影响[D].南华大学,2016.