CCD-1095Sk的应用

背景^[1-3]

CCD-1095Sk细胞是从左乳房的活体组织切片的正常皮肤建立。病人患有乳腺浸润性导管癌并患有乳头湿疹样癌本病。这一代次的细胞已经过两次数目倍增，约可再进行10次数目倍增。

CCD-1095Sk细胞

CCD-1095Sk细胞培养操作

1）复苏CCD-1095Sk细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）CCD-1095Sk细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）CCD-1095Sk细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.CCD-1095Sk细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

CCD-1095Sk细胞可以用于MiRNA-362-5p对乳腺癌恶性生物学行为的影响

多种的microRNA参与肿瘤的恶性转变过程，如恶性增殖，复发转移，凋亡抑制等。有研究报道，利用microRNA抑制剂降低乳腺癌细胞中高表达的miRNA-21后，抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移及肿瘤的生长。这一发现为乳腺癌的基因治疗提供的一个新的方向。本实验重点探讨一个新的miRNA-362-5p乳腺癌恶性生物学行为的影响，以及相关的作用机制。

在实验当中首先检测了乳腺癌细胞MCF-7、MB231与正常细胞CCD-1095SK中miRNA-362-5p的表达差异，发现miRNA-362-5p在乳腺癌细胞中呈现高表达。为了探讨miRNA-362-5p的高表达是否影响乳腺癌的生物学行为，将miRNA-362-5p的抑制剂转染MCF-7细胞，MTT法检测细胞增殖结果显示，当MCF-7细胞中miRNA-362-5p的表达被抑制后，细胞的增殖能力受到了明显抑制。进一步通过流式细胞术检测发现这是由于转染后MCF-7细胞被限制在G0期向S期转化的进程中，而G2/M期未受明显影响。

随后，通过划痕实验及Transwell方法检测细胞迁移，结果显示实验组细胞的迁移能力受到了明显的抑制。Transwell方法检测侵袭能力同样表明实验组细胞的侵袭能力被抑制。为了进一步验证miRNA-362-5p对肿瘤细胞克隆形成能力的影响，我们运用平板克隆实验及软琼脂实验检测结果显示细胞的克隆形成能力明显下降，细胞粘附实验结果显示实验组细胞的粘附能力亦受到抑制。有文献报导指出，miRNA对肿瘤细胞的凋亡亦有影响，因此利用顺铂诱导细胞凋亡，通过流式细胞术来检测其对乳腺癌细胞凋亡能力的影响，结果显示实验组的凋亡细胞数显著高于对照组，以上这些实验结果说明miRNA-362-5p的高表达有可能促进了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而抑制了其凋亡的发生。

在实验室前期的研究当中发现，在白血病细胞中miRNA-362-5p通过靶向CYLD促进NF-κB信号通路的激活从而促进了白血病细胞的增殖和侵袭，为了验证在乳腺癌细胞中miRNA-362-5p是否同样是通过这一途径来发挥作用的，将miRNA-362-5p的抑制剂及模拟物分别转染MCF-7细胞及CCD-1095SK细胞，westernblot检测CYLD的表达情况及NF-κB信号通路的活化情况，结果显示在MCF-7细胞中当miRNA-362-5p被抑制后，CYLD的表达得到了恢复而入核的NF-κB则下调，在CCD-1095SK细胞中当miRNA-362-5p的表达恢复以后，CYLD的表达下调而入核的NF-κB则上调，由此说明在乳腺癌细胞中，miRNA-362-5p抑制了CYLD的表达从而促进了NF-κB信号通路的激活。

总而言之，实验结果表明miRNA-362-5p在乳腺癌MCF-7细胞中的高表达促进了细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制了细胞的凋亡，这一作用可能与其抑制了CYLD的表达从而促进了NF-κB信号通路的激活有关。

参考文献

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[3]Epithelial-Mesenchymal Transition in Cancer:Parallels Between Normal Development and Tumor Progression[J].Douglas S.Micalizzi;;Susan M.Farabaugh;;Heide L.Ford.Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,2010(2)

[4]Downregulation of miRNA-200c Links Breast Cancer Stem Cells with Normal Stem Cells[J].Yohei Shimono;;Maider Zabala;;Robert W.Cho;;Neethan Lobo;;Piero Dalerba;;Dalong Qian;;Maximilian Diehn;;Huiping Liu;;Sarita P.Panula;;Eric Chiao;;Frederick M.Dirbas;;George Somlo;;Renee A.Reijo Pera;;Kaiqin Lao;;Michael F.Clarke.Cell,2009(3)

[5]桂照华.MiRNA-362-5p对乳腺癌恶性生物学行为的影响[D].安徽医科大学,2013.