MSTO-211H的应用

背景^[1-3]

MSTO-211H是1985年从一位肺二相间皮瘤患者的胸水中建株的。这个病人接受过多种药物联合前期化疗。MSTO-211H细胞具有高亲和力的EGF结合位点，并表达神经元特异性烯醇酶(NSE)及人绒毛膜促性腺激素(HCG)的α与β亚基。未检测到左旋多巴胺脱羧酶(DDC)，邦巴辛与神经tensin。细胞过表达c-myc原癌基因，并没有观察到基因重排或扩增。V-src,v-abl,v-erb B,c-raf 1,Ha-ras,Ki-ras,和N-ras的表达呈阳性。未检测到N-myc,L-myc,c-myb,c-fos,v-fes,v-fms和v-sis癌基因的表达。

MSTO-211H

MSTO-211H细胞培养操作：

1)复苏MSTO-211H细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主

将含有1 mL人子宫颈表皮癌细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6 cm皿中，加入约4 mL完全培养基，培养过夜）。第三天换液并检查细胞密度。

2)MSTO-211H细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

d、将MSTO-211H细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3)MSTO-211H细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；

a、收集MSTO-211H细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。

b、根据MSTO-211H细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。

c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

MSTO-211H可以用于恶性胸膜间皮瘤中EZH2调控Hedgehog-Gli信号通路的机制分析

恶性胸膜间皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)作为一在全球范围内愈发常见的肿瘤,侵袭性高、预后不良,临床方面治疗措施有限。EZH2基因是近年发现与肺癌等多种恶性肿瘤发生发展及预后相关的染色质修饰转录抑制因子,有关EZH2在MPM中的功能作用以及通路机制亦逐渐展开。

目前,MPM的发病机制并未得到完全阐明,已有研究表明在MPM发生发展过程中Hedgehog-Gli信号通路的激活起着十分重要的作用,相关实验显示,在MPM中,作为E3泛素连接酶的核心成员Cul4A,其启动序列被EZH2所结合,而Cul4A通过mTOR激活Hedgehog-Gli1通路,因此我们推测,在MPM中EZH2与Hedgehog-Gli1信号通路存在某种关联,即在MPM中EZH2依赖mTOR信号从而调控Hedgehog-Gli信号通路。

本研究拟通过体外细胞实验,探索研究MPM中EZH2调控Hedgehog-Gli1信号通路是否依赖mTOR信号,阐明EZH2在恶性胸膜间皮瘤中的作用机制。目的:探索在恶性胸膜间皮瘤中EZH2调控Hedgehog信号通路的分子机制,阐明EZH2在恶性胸膜间皮瘤发生发展中的作用机制,寻找治疗恶性胸膜间皮瘤的内部通路以及潜在分子靶点。

方法:1.EZH2和Gli1低表达细胞株(MSTO-211H)的常规培养。

2. 重组质粒、空载质粒的扩增、提取,EZH2基因导入,获得EZH2高表达的细胞株。

3. 用mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)作用细胞,提取各组别细胞株的总RNA、蛋白质。

4. 用Real-time PCR以及Western blot分别检测Gli1、Gli1上游基因N-Myc及Gli1下游调控基因P21、Bcl-1的mRNA以及蛋白质的表达情况。

结果:1.MPM细胞株MSTO-211H中导入EZH2基因,可使Gli1高表达;加入mTOR信号抑制剂Rapamycin作用后,Gli1表达未见明显变化。

2. MPM细胞株MSTO-211H中导入EZH2基因,可使P21低表达;加入mTOR信号抑制剂Rapamycin作用后,P21表达量上升。

3. MPM细胞株MSTO-211H中导入EZH2基因,可使Bcl-1高表达;加入mTOR信号抑制剂Rapamycin作用后,Bcl-1表达量下降。

4. MPM细胞株MSTO-211H中导入EZH2基因,N-Myc表达量无明显变化;加入mTOR信号抑制剂Rapamycin作用后,N-Myc基因表达量降低。

结论:在恶性胸膜间皮瘤中EZH2可能活化Hedgehog-Gli信号通路,但其激活机制可能与mTOR信号无关。

参考文献

[1]Tremelimumab as second-line or third-line treatment in relapsed malignant mesothelioma(DETERMINE):a multicentre,international,randomised,double-blind,placebo-controlled phase 2b trial[J].Michele Maio;;Arnaud Scherpereel;;Luana Calabrò;;Joachim Aerts;;Susana Cedres Perez;;Alessandra Bearz;;Kristiaan Nackaerts;;Dean A Fennell;;Dariusz Kowalski;;Anne S Tsao;;Paul Taylor;;Federica Grosso;;Scott J Antonia;;Anna K Nowak;;Maria Taboada;;Martina Puglisi;;Paul K Stockman;;Hedy L Kindler.The Lancet Oncology,2017(9)

[2]Targeting molecules to medicine with mTOR,autophagy and neurodegenerative disorders[J].Kenneth Maiese.British Journal of Clinical Pharmacology,2016(5)

[3]CTLA-4 and PD-1 Pathways:Similarities,Differences,and Implications of Their Inhibition[J].Elizabeth I.Buchbinder;;Anupam Desai.American Journal of Clinical Oncology,2016(1)

[4]Knockdown of CUL4A inhibits invasion and induces apoptosis in osteosarcoma cells[J].Jia Song;;Jing Zhang;;Jiang Shao.International Journal of Immunopathology and Phar,2015(2)

[5]李智昊.恶性胸膜间皮瘤中EZH2调控Hedgehog-Gli信号通路的机制分析[D].内蒙古医科大学,2019.