人间皮瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人间皮瘤细胞于1990年11月建株。组织提供者男性不抽烟。

人间皮瘤细胞

人间皮瘤细胞培养步骤：

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人间皮瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）人间皮瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

人间皮瘤细胞细胞处理：

1）冻存人间皮瘤细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）人间皮瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人间皮瘤细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人间皮瘤细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

应用^[4][5]

人间皮瘤细胞可以用于重组腺病毒携带p53联合抗癌药物对间皮瘤的抗肿瘤效果研究

通过强制表达p53(Ad-p53):以腺病毒为载体,p53为治疗基因,检测是否会抑制间皮瘤细胞的生长,以及Ad-p53与顺铂或培美曲塞联用是否产生抗肿瘤效果。

结果显示Ad-p53进行间皮瘤转导,诱导P53磷酸化,从而上调p21和下调phos-Rb表达水平,并引起细胞凋亡蛋白酶8(caspase-8)和3(caspase-3)的剪切,从而引起癌细胞凋亡;细胞周期分析显示出增加的G0/G1期比例以及sub-G1期比例,主要取决于细胞类型和Ad-p53的剂量;体外实验Ad-p53转导抑制了间皮瘤细胞活性并以协同的方式,增强了顺铂或培美曲塞的抑制效应;胸腔内注射Ad-p53和顺铂全身给药在原位动物模型产生出抗肿瘤效果。这些数据共同表明腺病毒携带P53基因(Ad-p53)是一种可以与一线药物联合治疗间皮瘤的方法。

方法:本研究选用人体间皮瘤细胞系,人间皮瘤细胞,NCI-H2052,NCI-H226,NCI-H28及MSTO-211H。通过MTT实验,检测Ad-p53的转导对此5种间皮瘤细胞系的增殖抑制效果。使用流式细胞周期分析方法检测Ad-p53对细胞周期变化的影响。以Western blot方法研究Ad-p53转导引起的细胞凋亡传导通路。MTT实验,检测Ad-p53和CDDP或PEM联合用药产生协同的癌细胞抑制作用。最后又运用动物体内实验,检测Ad-p53和CDDP的联合抗肿瘤效果。

结果:1 MTT分析结果Ad-p53基因治疗,除了NCI-H2052细胞外,以剂量依赖方式抑制了NCI-H28、人间皮瘤细胞、NCI-H226和MSTO-211H间皮瘤细胞的生长,而对照组Ad-LacZ则未抑制间皮瘤细胞的生长。50%抑制浓度值(IC50)显示NCI-H28细胞对Ad-p53最敏感,随后是人间皮瘤细胞细胞,而NCI-H226和MSTO-211H细胞敏感程度相似。NCI-H2052细胞对Ad-p53不敏感,部分原因可能是Ad受体的低表达水平。

2流式细胞周期分析结果Ad-p53感染间皮瘤细胞系MSTO-211H和NCI-H28。Ad-p53诱导了MSTO-211H细胞G0/G1期的静止和sub-G1的增加;而Ad-p53感染NCI-H28细胞后显现出G2/M期比例增加,S期比例下降,及明显的sub-G1的增加。与MSTO-211H细胞相比,NCI-H28细胞的sub-G1增加的更为显著,显示出NCI-H28细胞对Ad-p53介导的细胞凋亡具有更高的敏感性。

3蛋白质印迹分析结果

3.1蛋白质印迹分析法检测了在MESO-211H和NCI-H28细胞中Ad-p53介导的分子传导通路。Ad-p53诱导P53磷酸化及P21表达水平的增加。Phos-Rb的下调,相当于从磷酸化状态到非磷酸化状态的转换。以上数据共同表明Ad-p53激活了p53介导的分子传导通路;

3.2在MSTO-211H和NIC-H28两个细胞系中,Ad-p53转导后诱发了caspase-3和caspase-8的剪切,却没有诱导caspase-9的剪切。Bid表达水平保持不变,t-Bid在两种细胞中均未检测到。这些数据共同表明Ad-p53转导通过caspase-8激活了的死亡受体介导的外源性凋亡通路,但通过caspase-9线粒体介导的内源性凋亡通路却很可能未被涉及。

参考文献

[1]Enhancement of Ad‐p53 Therapy with Docetaxel in Head and Neck Cancer[J].George H.Yoo;Marie P.Piechocki;JefferyOliver;FulvioLonardo;LouZumstein;Ho‐ShengLin;HaroldKim;Terry Y.Shibuya;NasfatShehadeh;John F.Ensley.The Laryngoscope,2009(11)

[2]CARPs are E3 ligases that target apical caspases and p53[J].Wensheng Yang;;Wafik S.El-Deiry.Cancer Biology&Therapy,2007(11)

[3]Clinical significance of the p53 pathway and associated gene therapy in non-small cell lung cancers[J].Cheng-long Huang;;Hiroyasu Yokomise;;Akira Miyatake.Future Oncol.,2007(1)

[4]Gene therapy for lung cancer[J].Eric M.Toloza;Michael A.Morse;H.KimLyerly.J.Cell.Biochem.,2006(1)

[5]杨珊.重组腺病毒携带p53联合抗癌药物对间皮瘤的抗肿瘤效果研究[D].河北医科大学,2011.