SW 1990的应用

背景^[1-3]

SW 1990是1978年从一II级胰腺癌的脾转移中分离建系。可在裸鼠中成瘤。有报道该细胞只有29%的克隆形成率。

SW 1990

SW 1990细胞培养方法：

1、SW 1990细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将SW 1990细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、SW 1990细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、SW 1990细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；

③将SW 1990细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

应用^[4][5]

SW 1990可以用于姜黄素增强吉西他滨抗胰腺癌的机制研究

研究是基于肿瘤增殖,迁移及侵袭探讨姜黄素是否可在体内外增强吉西他滨对胰腺癌的抗肿瘤作用及其机制的研究,为临床治疗胰腺癌提供理论及实验依据。

方法:1.Western blot法检测胰腺癌细胞株AsPC-1,BxPC-3,Panc-1和SW1990中Id1蛋白表达;应用CCK8法获得姜黄素、吉西他滨的IC50值,检测姜黄素和/或吉西他滨对胰腺癌细胞增殖的影响;Compusyn软件分析姜黄素与吉西他滨的协同指数,确定两者在联合用药中的剂量;划痕实验检测姜黄素和/或吉西他滨对胰腺癌细胞迁移能力的影响;Transwell实验检测姜黄素和/或吉西他滨对胰腺癌细胞侵袭能力的影响;Western blot法检测姜黄素和/或吉西他滨对胰腺癌细胞内EMT相关蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表达水平的影响;

2. 应用CCK8法获得Srcinhibitor 1(Src-I1)的IC50值,检测Src-I1对胰腺癌胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell实验检测Src-I1对细胞侵袭能力的影响,Western blot法检测Src-I1对胰腺癌细胞内Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表达水平的影响;构建Id1过表达(AsPC-1-Id1)及敲减细胞株(SW1990-shId1),qRT-PCR检测Id1 mRNA表达水平。Transwell实验检测过表达及敲减Id1对细胞侵袭能力的影响。Western blot法检测过表达及敲减Id1对胰腺癌细胞内EMT相关蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Id1蛋白表达水平的影响;

3. 体外培养胰腺癌细胞AsPC-1和SW1990,分为对照组,TGF-β1组,TGF-β1+姜黄素组,TGF-β1+吉西他滨组,以及TGF-β1+姜黄素+吉西他滨组;Transwell实验检测药物对细胞侵袭能力的影响;Western blot法检测药物对胰腺癌细胞内EMT相关蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表达水平的影响;

4. 构建胰腺癌细胞SW1990裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组,姜黄素组,吉西他滨组,以及姜黄素+吉西他滨组;观察药物在体内对裸鼠移植瘤生长的影响;TUNEL检测药物对裸鼠移植瘤凋亡的影响;免疫组织化学法检测药物对裸鼠移植瘤中Id1,E-cadherin及Ki-67表达水平的影响;Western blot法检测药物对裸鼠移植瘤中凋亡相关蛋白(Bax,Bcl-2,Caspase-3),EMT相关蛋白(MMP9,SNAIL,E-cadherin)及Src/Id1通路蛋白(Id1,p-Src,Src)表达水平的影响。

结果:1.在胰腺癌细胞株AsPC-1,BxPC-3,Panc-1和SW1990中,SW1990细胞中Id1蛋白表达最高,AsPC-1细胞中表达最低;体外细胞实验表明,姜黄素与吉西他滨有协同效应,相较于单独应用姜黄素或者吉西他滨,姜黄素可显著增强吉西他滨在胰腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭方面的抑制作用;并且姜黄素增强了吉西他滨下调胰腺癌细胞内MMP9,SNAIL,Id1,p-Src蛋白的表达,同时上调E-cadherin蛋白的表达的能力;

2. Src-I1显著抑制了胰腺癌细胞的增殖与侵袭能力,并显著降低了胰腺癌细胞株中的Id1及p-Src蛋白表达;慢病毒构建的Id1过表达胰腺癌细胞株中,Id1 mRNA显著上调,Id1,MMP9及SNAIL蛋白表达显著上调,E-cadherin蛋白表达显著下调;在慢病毒构建的Id1敲减胰腺癌细胞株中,Id1 mRNA显著下调,Id1,MMP9及SNAIL蛋白表达显著下调,E-cadherin蛋白表达显著上调;Transwell实验证实Id1敲减后胰腺癌癌细胞SW1990侵袭力显著减弱;相反,Id1过表达胰腺癌细胞AsPC-1侵袭力显著增强;

3.姜黄素和/或吉西他滨可以抑制TGF-β1诱导的胰腺癌细胞的侵袭能力;胰腺癌细胞经TGF-β1作用后,MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表达相较于对照组显著上调,E-cadherin蛋白表达显著下调,后经姜黄素、吉西他滨、姜黄素+吉西他滨处理后,MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表达相较于TGF-β1处理的胰腺癌细胞显著下调,E-cadherin蛋白表达显著上调;与单独应用姜黄素或吉西他滨相比,姜黄素+吉西他滨组显著抑制TGF-β1诱导的胰腺癌细胞侵袭,下调TGF-β1诱导的胰腺癌内MMP9,SNAIL,Id1及p-Src蛋白表达,以及上调E-cadherin蛋白表达的能力。

参考文献

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[4]Curcumin enhances anti?cancer efficacy of either gemcitabine or docetaxel on pancreatic cancer cells.[J].Liu Pan;Ying Qian;Liu Huan;Yu SiQi;Bu LuPing;Shao Liang;Li XinYi.Oncology reports,2020(4)

[5]牛楠.姜黄素增强吉西他滨抗胰腺癌的机制研究[D].浙江中医药大学,2022.