NCCIT人畸胎癌细胞的应用

背景^[1-3]

NCCIT人畸胎癌细胞是从一个纵膈混合型生殖细胞肿瘤中建立了NCCIT细胞系。这株多能性干细胞可以分化成体细胞和胚外组织。未分化细胞介于精原细胞癌和胚胎癌之间。在维甲酸作用下分化。角蛋白阴性。波形蛋白及胎盘碱性磷酸酶阳性。

NCCIT人畸胎癌细胞

一．NCCIT人畸胎癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%

2）该细胞在1640(含1.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的1640含有较高浓度的NaHCO3（3.7g/L），若使用1640（3.7g/L NaHCO3）培养基培养细胞时需要提高CO2浓度（7%-10%）。

3）NCCIT人畸胎癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

4）NCCIT人畸胎癌细胞冻存液：90%FBS，10%DMSO，现用现配。

二．NCCIT人畸胎癌细胞处理：

1）冻存NCCIT人畸胎癌细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）NCCIT人畸胎癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁NCCIT人畸胎癌细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）NCCIT人畸胎癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。

应用^[4][5]

NCCIT人畸胎癌细胞可以用于Cripto-1蛋白的表达及多克隆抗体的制备

肿瘤是目前人类的多发病,其死亡率仅次于心血管疾病。肿瘤的发生与细胞内原癌基因有密切的关系,肿瘤的形成多伴随着原癌基因表达产物的增多。Cripto-1,也称为畸胎瘤衍化生长因子(teratocarcinoma-derived growth factor-1,TDGF-1),发现于1987年,是从未分化的人畸胎瘤细胞NTERA2细胞系cDNA文库中钓取并鉴定的基因。

Cripto-1蛋白内部具有标志性EGF-CFC功能结构域,可与细胞表面多种受体结合行使功能。Cripto-1可作为辅助因子参与TGF-β家族成员的多个细胞信号通路的传递过程,还参与活化多条控制细胞增殖与凋亡能力的信号通路。Cripto-1的生物学作用有很多,包括胚胎发育中原肠胚的形成,哺乳动物乳腺发育和乳蛋白表达,血管发生等。Cripto-1与肿瘤有极高的相关性,在多种癌细胞和组织中有异常高的表达水平,而在正常的细胞系中则表达量很低或不表达。Cripto-1在肿瘤细胞的形成、恶变及转移过程中起作用、是公认的原癌基因。

本研究首先将Cripto-1的功能区,即EGF-CFC结构域基因克隆入原核表达载体,进而对目的蛋白进行原核表达,在对表达条件进行优化后对表达产物进行了分离、纯化和复性。并进一步用纯化的蛋白免疫新西兰兔获得兔源多克隆抗体。之后应用此多克隆抗体对多种人源的肿瘤细胞及正常细胞系中Cripto-1的表达进行了检测。本研究为进一步探讨Cripto-1的生物学功能及以Cripto-1为靶点的肿瘤诊断试剂的研发奠定了物质基础。

参考文献

[1]Transforming growth factorα,amphiregulin and cripto-1 are frequentlyexpressed in advanced human ovarian carcinomas[J].Antonio D'Antonio;;Simona Losito;;Sandro Pignata;;Michele Grassi;;Francesco Perrone;;Antonella De Luca;;Rosa Tambaro;;Caterina Bianco;;William Gullick;;Gibbes Johnson;;Vincenzo Iaffaioli;;David Salomon;;Nicola Normanno.International Journal of Oncology,2002(5)

[2]Nodal Signals to Smads through Cripto-Dependent and Cripto-Independent Mechanisms[J].Chang-Yeol Yeo;;Malcolm Whitman.Molecular Cell,2001(5)

[3]Identification of Cripto-1 in human milk[J].Caterina Bianco;Christian Wechselberger;Andreas Ebert;Nadia I.Khan;Youping Sun;David S.Salomon.Breast Cancer Research and Treatment,2001(1)

[4]Membrane-anchorage of Cripto protein by glycosylphosphatidylinositol and its distribution during early mouse development[J].Gabriella Minchiotti;;Silvia Parisi;;Giovanna Liguori;;Massimo Signore;;Gabriella Lania;;Eileen D Adamson;;Carmine T Lago;;M.Graziella Persico.Mechanisms of Development,2000(2)

[5]石莹.Cripto-1蛋白的表达及多克隆抗体的制备[D].东北师范大学,2008.