TRICINE-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒的应用

背景^[1-3]

TRICINE-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒是目前电泳法变性分离多肽的主要方法，适用于低分子量蛋白（2.5-40 kD）蛋白的分离。此试剂盒可以制备20或50块0.75 mm×14 cm×14 cm胶。对于大于5 kD的蛋白，无需制备隔离胶，双层胶足以分离。对于小于5 kDa的蛋白，需要制备3层胶才能较好的分离。

TRICINE-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

推荐使用4%浓缩胶，10%隔离胶，16%分离胶作为标准浓度，可以分辨出1-5 kD的片段。Tricine-SDS-PAGE系统不同于常规的SDS-PAGE，使用两种缓冲液电泳，电泳槽内槽是1×阴极缓冲液，含有Tricine和SDS。外槽是1×阳极缓冲液，为0.2M Tris。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，两种聚丙烯酰胺凝胶电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有如SDS等，在电泳的过程中蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离某种特定的有生物学活性的成分；

SDS-PAGE使用SDS使蛋白溶解、变性并带上大量负电荷，每微克蛋白质结合SDS的量是一定的，这样就使每单位质量蛋白质有一定的电荷密度，因此可以根据多肽链的分子质量进行分离。常规SDS-PAGE凝胶电泳适用于分离大分子蛋白，对于小分子量的蛋白或多肽，分辨率大大降低，则需要用Tris-Tricine缓冲液系统电泳。

应用^[4][5]

TRICINE-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒可以用于不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性及其Tricine-SDS-PAGE分析

以饥饿处理后的黄粉虫(Tenebrio molitor)幼虫为试验材料,通过饲4株细菌、针刺后饲10株真菌、1株放线菌诱导免疫,经研磨、加热、冷冻离心法获得抗菌肽提取物,采用抑菌圈法测定其对24种植物病原真菌和2种动物病原细菌抑菌活性,利用三等分法划分四种类型评价抑菌活性及抑菌谱;计算抑菌活性前3位处理的频次;用Tricine-SDS-PAGE法分离纯化、Gel-Pro analyzer软件分析不同菌源诱导免疫所产生的抗菌肽差异,测定主要活性成分的分子量。

结果如下:1、不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性上存在明显差异不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性较好的有番茄灰霉病病菌、黄瓜灰霉病病菌、白菜黑斑病病菌、辣椒根腐病病菌等,其中采用球孢白僵菌(家蚕)诱导后的提取物对番茄灰霉病病菌抑菌活性直径达到6.23mm,而采用浅灰链霉菌诱导后的提取物对小麦根腐病病菌抑菌活性直径达到0.94mm。对番茄灰霉病病菌、甘薯软腐病病菌的高活性、中活性区处理数之和最高(32个),各占总处理数(60)的53%,而对甘薯黑斑病病菌高活性、中活性区处理数之和最低(2个),占总处理数的3%;对甜瓜炭疽病病菌无活性处理数最高(44个),占总处理数73%,而对金黄色葡萄球菌无活性处理数最低(4个),占总处理数7%。

2、黄粉虫抗菌肽诱导处理间在抑菌谱方面存在明显差异与对照组相比,经枯草芽孢杆菌、Bt、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌诱导第1、2、3天诱导处理在高活性、中活性、低活性区抑菌水平抑菌谱数目增加,无活性抑菌谱数目明显减少,其中枯草芽孢杆菌诱导抑菌活性最为明显;经虫生真菌及生防放线菌浅灰链霉菌诱导处理绝大部分抑菌谱数在高活性区明显增加,中活性区增加,无活性区明显减少,而经普通真菌干酵母诱导处理基本维持在对照水平上。值得注意的是抗菌谱种类不尽相同。

3、黄粉虫抗菌肽抑菌活性前3位诱导处理频次上存在明显差异频次顺序依次为生防细菌、虫生真菌、杀虫放线菌及动物病原细菌等,其中枯草芽孢杆菌诱导处理出现频次最高,达到11.5,球孢白僵菌(家蚕)、Bt、CK(水)诱导处理出现频次最低,达到2.6,最高频次是最低频次的4.4倍左右。生防微生物可以更好地诱导昆虫抗菌肽的表达。

4、不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类有一定差异不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类不完全相同,同一菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽种类、数量随提取时间也存在一定差异。获得了4.2kD、5.2kD、6.6kD、6.9kD、11.0kD、12.6kD、13.2kD、14.7kD、17.8kD、18.7kD、23.6kD、24.4kD、25.1kD、25.3kD、25.8kD、26.0kD、27.6kD、28.5kD(已报道的在4.5kD左右)等一系列多肽条带(电泳纯)。例如对番茄灰霉病病菌效果好的球孢白僵菌(家蚕)诱导后第2天提取的黄粉虫抗菌肽表达了5.2kD、6.6kD、11.0kD、18.7kD等多肽。

5、选择适宜的诱导方式和提取时间对发掘抗菌肽资源非常重要本研究发现:诱导物种类和提取时间对诱导抗菌肽的种类、数量和活性有较大影响;不同诱导方式和提取时间所获抗菌肽种类和数量上的不同,是其抑菌活性和抑菌谱差异大的主要原因;抗菌肽的诱导表达存在着复杂的调控机制;诱导型抗菌肽在抑菌活性中起主要作用。

参考文献

[1]Production of cecropin A in transgenic rice plants has an impact on host gene expression[J].SoniaCampo;SilviaManrique;JoséGarcía‐Martínez;BlancaSan Segundo.Plant Biotechnology Journal,2008(6)

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[4]Genes that fight infection:what the Drosophila genome says about animal immunity[J].Ranjiv S.Khush;;Bruno Lemaitre.Trends in Genetics,2000(10)

[5]谢咸升.不同菌源诱导免疫的黄粉虫抗菌肽抑菌活性及其Tricine-SDS-PAGE分析[D].河北农业大学,2011.