HT29的应用

背景^[1-3]

HT29人结肠癌细胞，是从一名44岁的白人女性结直肠腺癌患者的原发肿瘤中分离出来，在结肠癌和毒理学研究中有应用。

HT29人结肠癌细胞

HT-29贴壁生长，显微镜下呈上皮细胞样，易成团生长。状态好时生长非常快，呈不规则的三角形，适合作为转染宿主，且在裸鼠中致瘤，可形成与结肠原发性（I级）一致的高分化腺癌，也能在类固醇处理的仓鼠中致瘤。此外，HT-29细胞还具备如下特性：

1)可合成IgA、CEA、转化生长因子β结合蛋白和粘液素等

2)表达尿激酶受体（u-PAR），但未检测到纤溶酶原激活物活性

3)细胞CD4表达阴性，但细胞表面表达半乳糖神经酰胺（一个HIV的可替代受体）

4) 致癌基因c-myc、K-ras、H-ras、N-ras、Myb、sis、fos表达阳性，过量产生p53抗原，在p53基因的273密码子处有G->A突变导致Arg->His替换，未检测到致癌基因N-myc。

HT-29细推荐使用1640，含10%胎牛血清，在37度、5%CO2培养箱中培养。细胞建议按1:3-1:4进行传代，室温胰酶消化2-3分钟即可，传代周期通常为3-4天。需要注意的是，HT-29复苏后周可能会有大量漂浮细胞，可更换新鲜培养液，同时将漂浮的细胞离心收集后加回到培养瓶中与贴壁细胞共同培养。新复苏的细胞会以补丁形态三维接触生长（即不是单层扁平生长），待细胞分裂生长后将会变回上皮细胞形态单层扁平生长。

一、HT29人结肠癌细胞复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述HT29细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把HT29细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.3天换一次培养基。

二、HT29人结肠癌细胞传代

1.培养皿中的HT29细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

4.HT29细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

6.把HT29细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

三、HT29人结肠癌细胞冻存

把细胞消化下来并离心（同上）。用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到**的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

HT29冻存液的配制：70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

应用^[4][5]

HT29可以用于基于EMT探讨重楼对结直肠癌细胞迁移和侵袭的作用机制

选取重楼及其单体,旨在探讨通过调控EMT,抑制结直肠癌迁移和侵袭的作用机制,阐明其对结直肠癌转移的抑制作用,为药物靶向作用于结直癌的转移提供实验支持,并为控制结直肠癌的转移提供新的思路与方法。

方法:(1)培养人结直肠癌HT29和LoVo细胞株。

(2) MTT法检测不同浓度的药物对HT29和LoVo细胞活力的影响,分析药物的IC50值;筛选并选取重楼最敏感单体进行后续实验。

(3) 平板克隆和Ed U增殖实验检测药物对细胞增殖作用的影响;Western-blotting检测药物干预后PI3K/Akt信号通路的蛋白表达。

(4) Transwell检测药物对细胞迁移、侵袭的影响;Western-blotting检测药物干预后EMT相关蛋白的表达。

结果:(1)人结肠癌HT29和LoVo细胞生长良好,适合进行实验操作。

(2) MTT实验结果显示PPE对HT29和LoVo细胞生长具有抑制作用,并且呈浓度相关性。

(3) 平板克隆和Ed U增殖实验结果表明,PPE对细胞增殖有抑制作用。

(4) Western-blotting检测PI3K/Akt相关蛋白表达,结果表明,PPE干预细胞后,与对照组相比,p-PI3K、p-Akt表达水平降低。

(5) Transwell结果表示,PPE抑制细胞的迁移和侵袭。

(6) Western-blotting检测EMT相关蛋白,结果表明,PPE干预细胞后,与对照组相比,E-cadherin表达水平增加,N-cadherin、MMP2、MMP9表达水平降低,Smad2、Smad3表达基本不变,p-Smad2、p-Smad3表达水平降低。

(7) 重楼内重楼皂苷Ⅰ(PPI)、重楼皂苷Ⅱ(PPII)、重楼皂苷VII(PPVII)的含量为检测重楼的质量标准,MTT结果显示PPI、PPII、PPVII对细胞活力均具有抑制作用,但PPVII对细胞活力抑制最明显,故选择PPVII进行后续实验。

(8) 平板克隆和Ed U增殖实验结果表明,PPVII对细胞增殖有抑制作用。

(9) Western-blotting检测PI3K/Akt相关蛋白表达,结果表明,PPVII干预细胞后,与对照组相比,p-PI3K、p-Akt表达水平降低。

(10) Transwell实验结果表示,PPVII抑制细胞的迁移和侵袭。

(11) Western-blotting检测EMT相关蛋白,结果表明,PPVII干预细胞后,与对照组相比,E-cadherin表达水平增加,N-cadherin、MMP2、MMP9表达水平降低,Smad2、Smad3表达基本不变,p-Smad2、p-Smad3表达水平降低。

结论:重楼通过体外实验研究表现出了一定的抗癌活性,其机制可能与PPVII通过调控PI3K、Akt的磷酸化水平抑制结直肠癌细胞的增殖,调控Smad2、Smad3磷酸化水平调控EMT过程,从而抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭,为重楼皂苷靶向治疗结直肠癌提供实验支持。

参考文献

[1]Molecular mechanism involved in epithelial to mesenchymal transition.[J].Jayachandran Jayashree;Srinivasan Harini;Mani Krishna Priya.Archives of biochemistry and biophysics,2021

[2]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J].Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021(3)

[3]A disintegrin and metalloproteinase 8 induced epithelial-mesenchymal transition to promote the invasion of colon cancer cells via TGF-β/Smad2/3 signalling pathway.[J].Jin Qianna;Jin Xin;Liu Tao;Lu Xiaoming;Wang Guobin;He Nan.Journal of cellular and molecular medicine,2020(22)

[4]Polyphyllin II inhibits human bladder cancer migration and invasion by regulating EMT-associated factors and MMPs.[J].Niu Weipin;Xu Li;Li Jingwei;Zhai Yi;Sun Zhonghua;Shi Wei;Jiang Yuehua;Ma Chenchen;Lin Haiqing;Guo Yanxia;Liu Zhiyong.Oncology letters,2020(3)

[5]侯亚妮.基于EMT探讨重楼对结直肠癌细胞迁移和侵袭的作用机制[D].山东中医药大学,2022.