A-204的应用

背景^[1-3]

A-204人横纹肌肉瘤细胞源自一位患有横纹肌肉瘤的1岁女孩的肌肉组织，由D.J.Giard建立。

A-204人横纹肌肉瘤细胞

人横纹肌肉瘤细胞（A-204）特性：

1）来源：横纹肌

2）形态：上皮细胞样，贴壁生长

3）含量：>1x106个/mL

4） 污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

人横纹肌肉瘤细胞（A-204）培养步骤：

一．人横纹肌肉瘤细胞（A-204）培养基及培养冻存条件准备：

1）准备McCoy`s 5A培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．A-204细胞处理：

1）复苏A-204细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）A-204细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁A-204细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）A-204细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，A-204细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

A-204可以用于卵泡抑素结构域在人A204横纹肌肉瘤细胞中对肌生成抑制素的抑制研究

肌生成抑制素，又名生长分化因子8，属于TGF-β超家族成员之一，主要是负调控骨骼肌的生长与发育，也是目前已知的最强的骨骼肌生长抑制物。利用生物技术方法来阻断肌生成抑制素的活性是目前最常用的恢复肌肉生长和治疗肌肉相关疾病的方法。

肌生成抑制素的抑制剂包括卵泡抑素、Decorin、Cripto、卵泡抑素相关基因产物、肌生成抑制素前肽、生长分化因子相关血清蛋白1、小富含谷酰胺三角形四肽重复蛋白、肌联蛋白以及可溶性激活素II型受体，大量研究结果表明，这些抑制剂均可通过与肌生成抑制素结合从而抑制其活性。

卵泡抑素，是一种富含半胱氨酸的单链糖蛋白。卵泡抑素对许多转化生长因子β超家族成员（如肌生成抑制素、激活素A、骨形成蛋白等）起拮抗作用，因此对不同细胞如肌肉细胞、成骨细胞、红细胞生成等有广泛的调节作用，具有多方面的生物学功能。卵泡抑素以高亲和性与肌生成抑制素和激活素A结合从而调节它们的活性，但是由于激活素A参与体内的多种生理活动，所以抑制激活素A的活性则会导致不仅仅骨骼肌的生理活动异常，还会影响机体的正常生理功能。晶体结构分析表明成熟的卵泡抑素由N-末端区，C-末端区和3个结构域（FS I，FS II和FS III）组成，而每一个结构域都有不同的配体结合活性。

研究表明与激活素A结合需要卵泡抑素的N-末端区以及FS I和FS II结构域的存在，而与肌生成抑制素结合的最小区域是N-末端区和FS I结构域，且FS I结构域的结合能力在3个结构域中最强。

增加FS I结构域或者删除FS II结构域可以显著增强对肌生成抑制素的结合活性，而不影响与激活素A的结合活性。目前对人及小鼠卵泡抑素各结构域功能的研究已有很多，但在家畜方面的研究还未见详细报道，为进一步研究增加FS I结构域能否增强对肌生成抑制素的活性调节，本研究构建了包含1个卵泡抑素的N-末端和3个连续的FS I结构域基因片段，构建的载体命名为FSI-I-I，并以人骨骼肌alpha肌动蛋白上游调控元件作为启动子，以鼠MCK增强子2作为FS I-I-I的增强子，促使其在骨骼肌中能高效表达；然后检测FS I-I-I分别与肌生成抑制素和激活素A的结合活性并在人A204横纹肌肉瘤细胞中研究FS I-I-I对MSTN信号通路的影响。

生物活性检测结果表明FS I-I-I能够高效抑制肌生成抑制素诱导的转录活性，而对激活素A诱导的转录活性无影响。细胞增殖实验表明转染FS I-I-I基因的人A204肌肉瘤细胞的增殖速度明显高于对照组。实时荧光定量PCR表明FS I-I-I基因能够促进肌生成抑制素下游因子MyoD的表达，Western Blot结果表明MSTN参与的信号通路（Smad信号通路、ERK信号通路和PI3k/Akt信号通路）因为FS I-I-I的参与而受到不同程度的影响。

综上所述，本实验构建的肌肉特异性表达载体FS I-I-I只影响与肌生成抑制素的生物活性，可以作为肌生成抑制素的特异性抑制剂，从而促进肌细胞增殖。本实验结果为构建骨骼肌特异性表达FS I-I-I转基因克隆猪奠定基础，从而在猪体内研究FS I-I-I对猪骨骼肌的影响。

参考文献

[1]Myostatin inhibition in muscle,but not adipose tissue,decreases fat mass and improves insulin sensitivity.[J].Tingqing Guo;;William Jou;;Tatyana Chanturiya;;Jennifer Portas;;Oksana Gavrilova;;Alexandra C McPherron.PLoS ONE,2017(3)

[2]Analysis of myostatin and its related factors in various porcine tissues1[J].J Jiao;;T Yuan;;Y Zhou;;W Xie;;Y Zhao;;J Zhao;;H Ouyang;;D Pang.Journal of Animal Science,2011(10)

[3]Secreted proteins from adipose tissue and skeletal muscle–adipokines,myokines and adipose/muscle cross-talk[J].Paul Trayhurn;;Christian A.Drevon;;Jürgen Eckel.Archives of Physiology and Biochemistry,2011(2)

[4]Myostatin-deficient mice exhibit reduced insulin resistance through activating the AMP-activated protein kinase signalling pathway[J].C.Zhang;;C.McFarlane;;S.Lokireddy;;S.Bonala;;X.Ge;;S.Masuda;;P.D.Gluckman;;M.Sharma;;R.Kambadur.Diabetologia,2011(6)

[5]袁婷.卵泡抑素结构域在人A204横纹肌肉瘤细胞中对肌生成抑制素的抑制研究[D].吉林大学,2012.