NCI-H460的应用

背景^[1-3]

NCI-H460是从一位大细胞肺癌患者的胸水中建立。细胞表达的p53 mRNA易于检测，其水平与正常肺细胞相当，未表现出DNA总体结构异常。角蛋白和波形蛋白纤维染色阳性，神经丝三联体蛋白阴性。

NCI-H460

NCI-H460细胞处理：

1）复苏NCI-H460细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H460细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到NCI-H460细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

3）NCI-H460细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，NCI-H460细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

NCI-H460可以用于木棉花水提物对人肺癌NCI-H460细胞体内外抑制作用及机制研究

以人肺癌NCI-H460细胞为研究对象,研究木棉花水提物对人肺癌NCI-H460细胞体外的抑制作用,并建立人肺癌NCI-H460细胞裸鼠移植瘤模型,探讨其抑瘤作用及机制。

方法:1.常规培养NCI-H460细胞后,不同浓度(20、40、80、160、320、640、1280、2560μg/mL)的木棉花水提物分别作用NCI-H460细胞24、48、72h后,采用MTT法检测木棉花水提物对NCI-H460细胞增殖抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50)。

2. 人肺癌NCI-H460细胞培养至对数生长期,状态较好时,取细胞密度为1×107/mL的混悬液0.2mL接种于裸鼠右后肢皮下,成功建立NCI-H460细胞裸鼠移植瘤模型。

3. 选取造模成功的荷瘤裸鼠20只,随机分为模型组、木棉花水提物高、低剂量组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组,每组5只。另取5只正常裸鼠作为正常组。正常组和模型组予等体积的蒸馏水灌胃,每天一次;木棉花水提物组分别以木棉花水提物生药量浓度1.2g/kg、0.6 g/kg的剂量灌胃,每天一次;CTX组以CTX 0.025 g/kg的剂量腹腔注射(ip),隔天给药一次。给药期间,隔天测量裸鼠移植瘤体积。持续给药干预13 d。第14d摘眼球法取血后,脱颈法处死裸鼠,剥取瘤体、肺脏、脾脏和肝脏,并分别称重计算抑瘤率、肺脏指数、脾脏指数和肝脏指数。

4.采用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定血清中白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量。

5.采用WST-1法测定肿瘤组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量;硫代巴比妥酸法(TBA法)测定肿瘤组织中丙二醛(MDA)的含量。

6.苏木素-伊红染色法(HE)观察瘤组织的病理形态学变化。

7.采用酶免疫组化法观察木棉花水提物对人肺癌NCI-H460裸鼠移植瘤组织中Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2、p53蛋白表达的影响。

结果:1.体外MTT实验结果显示,各浓度木棉花水提物作用48h和72h后,对人肺癌NCI-H460细胞的增殖抑制作用显著,且在一定范围内,增殖抑制作用随给药浓度和作用时间的增加而增加。作用48h后木棉花水提物各浓度对人肺癌NCI-H460细胞的抑制率分别为12.2%、18.3%、19.1%、13.4%、15.8%、21.8%、34.6%、62.6%,作用72h后抑制率分别为7.4%、14.4%、14.8%、31.3%、40.5%、48.7%、58.2%、75.8%。作用48h后半数抑制浓度(48h-IC50)为2002.4μg/mL;作用72h后72h-IC50为728.4μg/mL。

2. 人肺癌NCI-H460细胞裸鼠移植瘤造模成功,成瘤率为100%。

3. 处死裸鼠后剥离瘤体测定结果显示,与模型组比较,木棉花水提物高剂量组裸鼠移植瘤的体积和瘤重均显著减小(P<0.01),木棉花水提物低剂量组移植瘤的体积和瘤重与模型组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。木棉花水提物高、低剂量组的抑瘤率分别为59.7%、30.5%。

4. ELISA法检测结果显示,木棉花水提物高剂量组血清中TNF-α含量与正常组比较,差别无统计学意义(P>0.05),木棉花水提物低剂量组血清中TNF-α含量低于正常组(P<0.01);与模型组比较,木棉花水提物高剂量组血清中TNF-α含量高于模型组,差别有统计学意义(P<0.05);木棉花水提物高、低剂量组血清中IL-6水平与正常组比较,差别无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,木棉花水提物高、低剂量组血清中IL-6水平显著升高,差别有统计学意义(P<0.01)。

5.抗氧化实验结果显示,木棉花水提物高、低剂量组肿瘤组织中MDA含量均低于模型组,差别有统计学意义(P<0.01);木棉花水提物高剂量组肿瘤组织中SOD活力显著高于模型组(P<0.01),但低剂量组肿瘤组织中SOD活力与模型组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。

参考文献

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[5]唐微艳.木棉花水提物对人肺癌NCI-H460细胞体内外抑制作用及机制研究[D].广西医科大学,2019.