人骨髓瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人骨髓瘤细胞是由骨髓瘤患者的恶性积液建立的。是一株人骨髓瘤细胞，主要用于人骨髓瘤疾病研究等。

人骨髓瘤细胞

人骨髓瘤细胞细胞特性:

1)来源：人骨髓

2)形态：淋巴母细胞样，悬浮生长

3)含量：>lxl06个/mL

4)污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性。

人骨髓瘤细胞细胞接受后的处理：

1.收到细胞后，请检查是否漏液。

2.请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将T25瓶置于37°C培养约2-3h。

3.弃去T25瓶中的培养基，添加6ml完全培养基。

4.如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代，传代培养用6ml完全培养基。

5.接到细胞次日，请检查细胞是否污染。

人骨髓瘤细胞细胞培养操作规程

1)人骨髓瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

准备RPIVM-1640培养基，90%;优质胎牛血清，10%;50 y M 2-巯基乙醇。

人骨髓瘤细胞培养条件：气相：空气，95%;二氧化碳，5%。温度：37°C，培养箱湿度为70%-80%。

人骨髓瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2)人骨髓瘤细胞细胞处理：

复苏人骨髓瘤细胞细胞：将含有lmL细胞悬液的冻存管迅速放入37°C水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入lmL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

人骨髓瘤细胞细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加l-2mL培养液后吹句，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

人骨髓瘤细胞细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM，常温条件下离心5分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走)，加入部分新鲜培养基，吹打均匀后，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。

应用^[4][5]

人骨髓瘤细胞可以用于冬凌草甲素体外诱导骨髓瘤细胞H929和MM.1S凋亡与Akt信号通路

冬凌草甲素诱导H929和MM.1S细胞凋亡的实验研究目的:探讨ORI对人多发性骨髓瘤细胞H929和MM.1S增殖和凋亡的影响,及可能的作用机制。

方法:1.0、1、2、4、8、16、32μM ORI分别处理H929和MM.1S细胞12、24和36 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率。2.0、8、12、16μM ORI处理H929细胞24h和0、2、4、8μM ORI处理MM.1S细胞24h,光学显微镜下观察细胞形态学变化;TUNEL+DAPI法检测细胞凋亡;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。3.蛋白印迹技术(Western blot,WB)检测一定浓度ORI处理前后Bax、BCL-2、caspase-3、PARP以及PI3K、P-PI3K、Akt、P-Akt的表达变化。

结果:1.1、2、4、8、16、32μM ORI体外能有效抑制多发性骨髓瘤H929和MM.1S细胞增殖,与浓度、时间呈正相关(P<0.05);在H929细胞,12h、24h、36h的IC50值分别为21.32±0.45μM,14.05±0.71μM,11.37±0.87μM;在MM.1S细胞,12h、24h、36h的IC50值分别为9.18±0.22μM,6.05±0.36μM,4.37±±0.87μM;ORI(1、2、4、8μM)对MM.1S细胞的增殖抑制率较H929细胞更为显著(P<0.05)。

2. 与对照组比较,在光学显微镜下观察到H929和MM.1S细胞明显的核固缩、核碎裂征象;TUNEL+DAPI染色后荧光显微镜下可见H929和MM.1S细胞核固缩、凋亡小体等细胞凋亡特征。

3. AnnexinV-FITC联合PI双染流式细胞术检测发现,H929和MM.1S细胞凋亡率呈浓度依赖性递增,H929细胞24h细胞凋亡率分别为(1.17±0.46)%,(7.30±1.28)%,(23.30±2.1 3)%,(57.20±2.60)%(P<0.05);MM.1S细胞24h细胞凋亡率分别为(1.48±0.3 9)%,(2.06±0.55)%,(8.25±1.43)%,(37.13±3.60)%(P<0.05)。

4. WB结果提示,随着ORI浓度的增加,两株细胞pro-caspase-3、BCL-2、p-PI3K、p-Akt表达呈浓度依赖性递减,而Bax、Cleaved PARP表达递增,说明细胞发生凋亡。

结论:一定浓度ORI在体外能有效抑制骨髓瘤细胞株H929和MM.1S细胞增殖,诱导细胞凋亡;其可能的分子机制与下调PI3K/Akt信号通路相关蛋白有关。

参考文献

[1]Oridonin‐induced mitochondria‐dependent apoptosis in esophageal cancer cells by inhibiting PI3K/AKT/mTOR and Ras/Raf pathways[J].Jin‐Huan Jiang;;Jiang Pi;;Hua Jin;;Ji‐Ye Cai.Journal of Cellular Biochemistry,2019(3)

[2]Phorbol esters induce PLVAP expression via VEGF and additional secreted molecules in MEK 1‐dependent and p38,JNK and PI 3K/Akt‐independent manner[J].B.JoNell Hamilton;;Dan Tse;;Radu V.Stan.Journal of Cellular and Molecular Medicine,2019(2)

[3]Successful retreatment with lenalidomide for relapsed and refractory multiple myeloma previously treated with bortezomib,lenalidomide and pomalidomide[J].Satoko Oka MD,PhD;;Kazuo Ono MD;;Masaharu Nohgawa MD.Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics,2018(6)

[4]Disseminated adenovirus infection in a patient with relapsed refractory multiple myeloma undergoing autologous stem cell transplantation and pomalidomide/dexamethasone as salvage regimens[J].Shunichiro Yasuda;;Yuho Najima;;Tatsuya Konishi;;Yuta Yamada;;Toshiaki Takezaki;;Shuhei Kurosawa;;Masahiro Sakaguchi;;Kaito Harada;;Kosuke Yoshioka;;Aiko Igarashi;;Kyoko Inamoto;;Takashi Toya;;Takeshi Kobayashi;;Noriko Doki;;Kazuhiko Kakihana;;Hisashi Sakamaki;;Noritaka Sekiya;;Kazuteru Ohashi.Journal of Infection and Chemotherapy,2018

[5]常小刚.冬凌草甲素体外诱导骨髓瘤细胞H929和MM.1S凋亡与Akt信号通路[D].南京中医药大学,2019.