UM-UC-3的应用

背景^[1-3]

UM-UC-3源自一位病人的膀胱移行细胞癌的上皮细胞样的细胞系。

UM-UC-3

一．UM-UC-3培养基及培养冻存条件准备

1）准备MEM（推荐YJ-0012）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）UM-UC-3培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）UM-UC-3冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．UM-UC-3细胞处理：

1）冻存UM-UC-3细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2）UM-UC-3细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）UM-UC-3细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。

下面T25瓶为例；

1.UM-UC-3细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。

应用^[4][5]

UM-UC-3可以用于蛇葡萄素高水溶性制剂的制备及其对人膀胱癌UM-UC-3细胞增殖的抑制作用与机理研究

考察溶剂对蛇葡萄素(Amp)溶解度的影响;研究注射用蛇葡萄素(Amp)、蛇葡萄素标准品(Amp标准品)及注射用蛇葡萄素钠盐(Amp-Na)对人膀胱癌UM-UC-3细胞增殖的抑制作用并比较三种药物作用强度的差别;初步探讨蛇葡萄素(Amp)对人膀胱癌UM-UC-3细胞的作用机制。

方法:通过检测Amp溶液中是否存在丁达尔现象,确定其是否完全溶解;体外传代培养人膀胱癌UM-UC-3细胞,MTT比色法测定用Amp、Amp标准品及Amp-Na作用于细胞24、48及72 h对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测Amp对UM-UC-3细胞各周期细胞百分数的影响;用激光共聚焦显微镜测定Amp对UM-UC-3细胞线粒体膜电位及细胞内Ca2+浓度的变化。

结果:1.蛇葡萄素在PEG400、1,2-丙二醇各占15%,无水乙醇占70%的溶剂中溶解完全;Amp溶液最高浓度为50 mg/ml,可用5%葡萄糖注射液稀释。

2. MTT比色法检测结果显示:Amp作用于UM-UC-3细胞24、48及72 h的IC50值分别为57.13±8.52、45.50±6.98及40.35士1.62μg/ml;Amp标准品作用于UM-UC-3细胞24、48及72 h的IC50值分别为40.37±3.67、35.64±1.43及33.31±1.21μg/ml;Amp-Na作用于UM-UC-3细胞24、48及72 h的IC50值分别为51.60±4.62、47.27±3.98和42.45±1.94μg/ml。

3. 流式细胞术检测结果显示:与阴性对照组相比,Amp能使UM-UC-3细胞周期阻滞于G0/G1期,并在G0/G1期前出现凋亡峰。

4. 激光共聚焦实验结果显示:Amp作用于UM-UC-3细胞48 h后,可引起线粒体膜电位显著降低,并呈现出明显的剂量依赖性;细胞Ca2+浓度显著升高,无剂量依赖性。

结论:1.Amp溶剂中三种有机溶剂的配比为:PEG400 15%、1,2-丙二醇15%、无水乙醇70%。

2. Amp、Amp-Na及Amp标准品对人膀胱癌UM-UC-3细胞增殖均有显著的抑制作用,并呈现时间和浓度依赖性。

3. Amp标准品的细胞毒作用强于Amp及Amp-Na,Amp与Amp-Na药效相似;上述实验结果提示Amp及Amp-Na冻干制剂在制备过程中,药物略有降解或生物活性稍有丧失。

4.Amp体外可以通过线粒体途径诱导UM-UC-3细胞凋亡、使细胞周期阻滞于G0/G1期。

参考文献

[1]Fas death receptor signalling:roles of Bid and XIAP.[J].Kaufmann T;;Strasser A;;Jost P J.Cell death and differentiation,2012(1)

[2]BAX unleashed:the biochemical transformation of an inactive cytosolic monomer into a toxic mitochondrial pore.[J].Walensky Loren D;Gavathiotis Evripidis.Trends in biochemical sciences,2011(12)

[3]Mitochondria in Apoptosis:Bcl-2 Family Members and Mitochondrial Dynamics[J].Jean-Claude Martinou;;Richard J.Youle.Developmental Cell,2011(1)

[4]Communication between mitochondria and nucleus:Putative role for VDAC in reduction/oxidation mechanism[J].Hanna Galganska;;Andonis Karachitos;;Malgorzata Wojtkowska;;Olgierd Stobienia;;Malgorzata Budzinska;;Hanna Kmita.BBA-Bioenergetics,2010(6-7)

[5]王晓.蛇葡萄素高水溶性制剂的制备及其对人膀胱癌UM-UC-3细胞增殖的抑制作用与机理研究[D].兰州大学,2012.