BHT101的应用

背景^[1-3]

BHT101由一名罹患甲状腺未分化癌的63岁女性的淋巴结转移中建立；据报道，该细胞不产生激素，但甲状腺球蛋白和甲状腺素部分呈阳性。经本库STR检测结果无误。STR结果如下：D5S818:10,11；D13S317:12；D7S820:10,11；D16S539:9，11；vWA:19；THO1:9,9.3；Amelogenin:X；TPOX:8；CSF1PO:12,13。

BHT101

BHT101细胞培养操作

1）复苏BHT101细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）BHT101细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）BHT101细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.BHT101细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

BHT101可以用于青蒿琥酯调控E2F1抑制甲状腺癌增殖和侵袭的机制研究

通过研究青蒿琥酯对甲状腺癌细胞的影响,建立裸鼠移植瘤模型,在体外和体内探讨青蒿琥酯对甲状腺癌的抗癌作用,并探究其作用机制,拟为甲状腺癌患者预测淋巴结转移和预后评估提供新的可靠依据,并为肿瘤转移调控模式提供新的思路和完善依据,为开发新型治疗策略提供理论依据。

方法:1.体外实验(1)青蒿琥酯对甲状腺癌细胞增殖的影响。用20μM、40μM、80μM的青蒿琥酯处理甲状腺癌BHT101和TPC1细胞24h,同时设立阴性对照组。通过CCK-8实验检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖活力的影响。通过Ed U(5-Ethynyl-2’-deoxyuridine)实验和克隆形成实验进一步检测ART对BHT101和TPC1细胞增殖的影响。通过流式细胞术检测ART对BHT101和TPC1细胞周期和细胞凋亡的影响。通过Western-blot实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移相关蛋白E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白表达的影响。通过划痕实验检测ART对BHT101和TPC1细胞迁移能力的影响。通过Transwell实验检测ART对BHT101和TPC1细胞侵袭能力的影响。

(2) 青蒿琥酯对甲状腺癌细胞作用机制的研究。对青蒿琥酯处理的细胞及对照组细胞进行m RNA转录组二代测序,每组做三个平行。通过生物信息学对基因表达进行分析,筛选差异基因并富集基因,进行通路富集分析,同时进行GSEA分析。通过网络药理学分析进行分子对接寻找ART作用靶蛋白。

2. 体内实验(1)4周龄的雌性BABL/c裸鼠,适应性喂养1周,将TPC1细胞(2×107)皮下注射到裸鼠中,建立甲状腺癌异种移植裸鼠。将小鼠随机分为对照组和给药组,给药组小鼠进行灌胃给药,对照组小鼠给予生理盐水灌胃,一周后观察成瘤情况。每两天监测一次小鼠的肿瘤生长,5周后断颈处死裸鼠,在小鼠死亡后解剖取材,称重并进行后续实验。

3. 肿瘤组织行免疫组化Ki-67染色和Tunel染色,确定肿瘤细胞增殖指数和凋亡率。提取肿瘤组织的蛋白,利用Western-blot检测肿瘤组织中凋亡相关蛋白bax、bcl-2、RAPR的蛋白表达水平。同时通过Western-blot检测肿瘤组织中E2F1相关蛋白E2F1、c-Myc、Cyclin E的表达水平。

结果:1.体外实验(1)加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞的OD值均降低,且青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的OD值,青蒿琥酯剂量依赖性降低BHT101和TPC1细胞的细胞活力。加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞克隆集落数均减少,其中,低浓度(20μM)青蒿琥酯明显减少克隆集落数(P<0.05),中浓度(40μM)和高浓度(80μM)对克隆集落数形成的抑制能力更强(P<0.001),表明青蒿琥酯具有降低BHT101和TPC1细胞的增殖的能力。Ed U实验结果显示青蒿琥酯作用后Ki-67阳性数量减少,随着青蒿琥酯浓度的增加,Ki-67阳性细胞数量呈递减趋势。统计结果显示,青蒿琥酯抑制BHT101和TPC1细胞的增殖能力,且呈剂量依赖性。

划痕实验结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,划痕面积增加,且随着青蒿琥酯浓度增加划痕面积逐渐增加,表明青蒿琥酯降低BHT101和TPC1细胞的迁移能力。Transwell结果显示,青蒿琥酯孵育BHT101和TPC1细胞24小时后,与对照组相比,通过Transwell小室的细胞数量减少,呈剂量依赖性。结果显示ART降低BHT101和TPC1细胞的侵袭能力。此外,进一步通过Western-blot检测迁移相关蛋白的表达,从蛋白水平检测青蒿琥酯对甲状腺癌细胞迁移的影响。

结果显示,与对照组相比,随着青蒿琥酯浓度的增加,BHT101和TPC1细胞中E-钙粘蛋白表达增加,同时,波形蛋白和N-钙粘蛋白表达下降。进一步统计分析显示青蒿琥酯剂量依赖性地增加E-钙粘蛋白表达,抑制波形蛋白和N-钙粘蛋白表达(P<0.05)。通过流式细胞术分析可以看出,与对照组相比,加入青蒿琥酯后,BHT101和TPC1细胞凋亡的比率增加(P<0.01),呈剂量依赖性。

参考文献

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[2]Identification and validation of potential novel biomarkers to predict distant metastasis in differentiated thyroid cancer.[J].Wang Wenlong;Shen Cong;Zhao Yunzhe;Sun Botao;Bai Ning;Li Xinying.Annals of translational medicine,2021(13)

[3]Cremastra appendiculata(D.Don)Makino,a potential anti-tumor traditional Chinese medicine:Review.[J].Liu Junyu;He Chao;Tang Yan;Liu Wendao;Xu Yi;Li Zulun;Qin Xuhua;Jin Shenrui.Journal of ethnopharmacology,2021

[4]m6A demethylase FTO induces NELL2 expression by inhibiting E2F1 m6A modification leading to metastasis of non-small-cell lung cancer[J].Wang Yanyun;Li Man;Zhang Lin;Chen Yitong;Zhang Shoudan.Molecular Therapy-Oncolytics,2021(prep)

[5]朱见.青蒿琥酯调控E2F1抑制甲状腺癌增殖和侵袭的机制研究[D].山东中医药大学,2022.