NIH3T3的应用

背景^[1-3]

NIH3T3与原始的随机交配3T3和近交系BALB/c 3T3建株方法一样，NIH/3T3，是从NIH Swiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触抑制的连续细胞株。为了培育在形态学特征上更适合于进行转化分析的亚株，建立的NIH/3T3细胞株又进行了五轮以上亚克隆。这株细胞对DNA转化及转染研究十分有用。该细胞易于转染，对肉瘤病毒转化灶形成和白血病病毒增殖十分敏感。检测表明肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性。

NIH3T3

NIH/3T3是从NIHSwiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触性抑制的连续传代细胞株。为了培育在形态学特征上更适合于进行转化分析的亚株，建立的NIH/3T3细胞株又进行了5轮以上亚克隆。该细胞株对肉瘤病毒的转化灶形成和白血病病毒的繁殖高度敏感，对DNA转化及转染研究十分有用。

NIH3T3细胞培养操作

1）复苏NIH3T3细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NIH3T3细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）NIH3T3细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.NIH3T3细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

NIH3T3可以用于原花青素对TGF-β诱导NIH3T3细胞增殖及分化的影响

探讨原花青素对受TGF-β1诱导的NIH3T3细胞增殖及分化影响,并探讨其对PI3K/AKT通路的影响,为肺纤维化早期药物干预研究提供新思路及相关依据。

方法:将在体外培养的NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞,贴壁生长)作为研究对象,在体外适宜条件下培养,取对数生长的细胞接种在96孔板中待细胞贴壁后随机分为五组,A组(空白对照组)不加LY294002(PI3K抑制剂)、原花青素或TGF-β1药物;B组(TGF-β1组)仅仅加入5μg/L浓度的TGF-β1;C组(原花青素+TGF-β1组)先加入50μg/m L浓度的原花青素溶液预处理1h后,再加入TGF-β1(5μg/L);D组(LY294002+TGF-β1组)先加入10μmol/L浓度的LY294002作用1h后,再予以TGF-β1(5μg/L);E组(LY294002+原花青素+TGF-β1组)先加入LY294002(10μmol/L)作用1h,再加入原花青素(50μg/m L)作用1h,最后予以TGF-β1(5μg/L)。

以上五组经不同处理的NIH3T3细胞在条件适宜的普通细胞培养箱中培养24 h。分别于12、24、48 h点用CCK8法检测细胞增殖活力情况;观察记录五组细胞形态上的变化并检测各组细胞PI3K、AKT的m RNA表达情况以及α-SMA、Col-I、ρ-PI3K、ρ-AKT各蛋白的表达情况。

结果:1、细胞形态观察:倒置生物显微镜下可见A组为纺锤形或者星形的成纤维细胞,其余组可见扁平状结构的肌成纤维细胞,B组实验细胞在镜下较为明显。

2、CCK8检测结果:B组细胞增殖活力在12、24、48 h三个时间点均高于A组,C、D组细胞增殖活力在24、48 h两个时间点均高于A组但低于B组,E组细胞增殖活力在三个时间点均低于B组(差异具有统计学意义,P<0.05)。

3、WB结果示:加入药物的B、C、D、E四个实验组的α-SMA、Col-I的蛋白表达相比较于空白对照A组均有升高,C、D、E组此两种蛋白表达均较B组低,E组中α-SMA蛋白相比C、D组表达水平更低(差异具有统计学意义,P<0.05),C、D两组比较此两种蛋白表达水平无明显差异。加入药物的B、C、D、E四组实验组的ρ-PI3K、ρ-AKT的蛋白表达相比较于空白对照A组而言均有升高,四组实验组的蛋白表达水平由高到低依次为B组、C组、D组和E组(差异具有统计学意义,P<0.05)。

4、qRT-PCR结果显示:加入药物的B、C、D、E四组实验组的PI3K、AKT的m RNA表达相比较于空白对照A组而言均有升高,四组实验组的PI3K、AKT的m RNA表达水平由高到低依次为B组、C组、D组和E组(差异具有统计学意义,P<0.05)。

结论:原花青素可能通过下调TGF-β1-PI3K/AKT通路抑制NIH3T3细胞的增殖及分化。

参考文献

[1]The role of natural products in the prevention and treatment of pulmonary fibrosis:a review.[J].Wang Liqun;Li Sha;Yao Yuqin;Yin Wenya;Ye Tinghong.Food&function,2021(3)

[2]Traditional Chinese medicine combined with pulmonary drug delivery system and idiopathic pulmonary fibrosis:Rationale and therapeutic potential[J].Zhang Yukun;Lu Peng;Qin Huan;Zhang Yuelin;Sun Xinru;Song Xunan;Liu Jingjing;Peng Hui;Liu Yiting;Nwafor Ebuka Olisaemeka;Li Jiawei;Liu Zhidong.Biomedicine&Pharmacotherapy,2021

[3]Grape Seed Proanthocyanidin Extract Ameliorates Cardiac Remodelling After Myocardial Infarction Through PI3K/AKT Pathway in Mice[J].Ruan Yongxue;Jin Qike;Zeng Jingjing;Ren Fangfang;Xie Zuoyi;Ji Kangting;Wu Lianpin;Wu Jingguo;Li Lei.Frontiers in Pharmacology,2020

[4]A Network Pharmacology Approach to Explore the Potential Mechanisms of Yifei Sanjie Formula in Treating Pulmonary Fibrosis[J].Qiao Bo;Wu Yueying;Li Xiaoya;Xu Zhenyuan;Duan Weigang;Hu Yanan;Jia Wenqing;Fan Qiuyang;Xing Haijing;Liu Suhuan.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2020

[5]李江.原花青素对TGF-β诱导NIH3T3细胞增殖及分化的影响[D].南华大学,2021.