人乳腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人乳腺癌细胞是从胸水中建立了人乳腺癌细胞（SK-BR-3）。没有病毒颗粒。超微结构特征包括微丝和桥粒，肝糖原颗粒，大溶酶体，成束的细胞质纤丝。SK-BR-3细胞株过表达HER2/c-erb-2基因产物。

人乳腺癌细胞

人乳腺癌细胞培养步骤

一．人乳腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM（含NaHCO3 1.5g/L；)培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）注意:这个细胞对DMEM培养基中碳酸氢钠的含量需求是1.5g/L，购买和准备培养基的时候要注意碳酸氢钠的含量。

3）人乳腺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

4）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人乳腺癌细胞处理：

1）复苏人乳腺癌细胞：将含有1mL人乳腺癌细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人乳腺癌细胞传代：如果人乳腺癌细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于人乳腺癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人乳腺癌细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人乳腺癌细胞冻存：待人乳腺癌细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为类；

1，人乳腺癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬人乳腺癌细胞胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人乳腺癌细胞可以用于Erbin对Her2阳性乳腺腺癌细胞的迁移能力及赫赛汀耐药的影响及相关机制研究

研究中，发现在Her2阳性乳腺癌组织中，Erbin的表达显著降低，甚至出现了表达丢失的现象。实验结果表明，在Her2阳性的乳腺癌细胞中敲低Erbin表达可明显增强细胞的迁移能力，诱导乳腺癌细胞出现侵袭表型。同时还发现，敲低Erbin表达可诱导Her2阳性的乳腺癌细胞对治疗性单抗赫赛汀产生抗性。分子机制的研究表明，敲低Erbin主要通过诱导AKT信号通路的异常活化来实现上述的生物学效应。

这些结果提示，Erbin通过调控AKT信号通路影响乳腺癌细胞的迁移能力及对赫赛汀的耐药，从而可能在Her2阳性乳腺癌的恶性演进过程中发挥着重要作用。方法：应用Erbin特异性抗体、通过免疫组织化学染色在人乳腺癌组织芯片中检测Erbin在蛋白水平的表达情况；通过Oncomine数据库检索，探索在Her2阳性的乳腺癌组织中Erbin在mRNA水平的表达情况；

通过免疫印迹法及实时定量PCR检测在乳腺癌细胞系中，Erbin在转录水平及蛋白水平的表达情况；设计并构建了Erbin shRNA表达载体，通过细胞转染、病毒感染以及蛋白质免疫印迹，检测在Her2阳性乳腺癌细胞中敲低Erbin表达对Heregulin诱导的AKT信号通路活化的影响；通过构建Erbin真核表达载体、细胞转染及免疫印迹法检测了，在Her2阳性的乳腺癌细胞中过表达Erbin对Heregulin诱导的AKT活化的影响；

通过CCK8（细胞增殖检测），探索敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞增殖的影响；通过流式细胞术，检测敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞的细胞周期行进的影响；

通过二维培养条件下的细胞划痕实验，检测了敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞迁移能力的影响；通过Matrigel细胞三维培养法，检测敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞侵袭表型形成的影响；应用AKT及ERK信号通路的特异性抑制剂，探索敲低Erbin影响细胞迁移及侵袭表型形成的分子机制；通过细胞增殖检测实验，检测敲低Erbin表达对靶向Her2的治疗性抗体-赫赛汀细胞增殖抑制效应的影响；

通过细胞海绵三维细胞培养法，检测敲低Erbin对Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的影响；通过细胞锚定非依赖增殖检测法，探索敲低Erbin表达对Her2阳性乳腺癌细胞的赫赛汀敏感性的影响；应用AKT及ERK特异性抑制剂，探索Erbin影响Her2阳性乳腺癌细胞赫赛汀耐药的分子机制。

结果：1Erbin在乳腺癌及Her2阳性乳腺癌组织中表达显著降低免疫组化的结果表明，在所检测的10例正常乳腺组织中，8例呈现Erbin高表达（++-+++）；而在20例浸润性乳腺癌组织中，Erbin的表达水平普遍偏低，甚至出现了表达丢失的现象。

15例乳腺癌组织Erbin的表达水平为“+”或阴性，仅5例为“++”。在Oncomine数据库检索时发现了一组含有53例浸润性乳腺癌的样本。通过与正常乳腺组织进行比较，发现这是一组高Her2阳性率的乳腺癌样本，在53例样本中有52例为Her2阳性，仅有1例为Her2阴性。

参考文献

[1]Cell polarity proteins and cancer[J].Saskia I.J.Ellenbroek;;Sandra Iden;;John G.Collard.Seminars in Cancer Biology,2012(3)

[2]β2-AR-induced Her2 transactivation mediated by Erbin confers protection from apoptosis in cardiomyocytes[J].Ming Shi;;Mingzhen Zhao;;Meiru Hu;;Dan Liu;;Hong Cao;;Lu Qian;;Zhengyan Yang;;Yabin Hu;;Ming Yu;;Shuo Yang;;Yuanfang Ma;;Ning Guo.International Journal of Cardiology,2012

[3]Erbin,a Negative Regulator in Diverse Signal Pathways[J].Dan Liu;Ming Shi;Huijun Duan;Caili Han;Ning Guo.Current Protein&Peptide Science,2010(8)

[4]Biological and Molecular Heterogeneity of Breast Cancers Correlates with Their Cancer Stem Cell Content[J].Salvatore Pece;;Daniela Tosoni;;Stefano Confalonieri;;Giovanni Mazzarol;;Manuela Vecchi;;Simona Ronzoni;;Loris Bernard;;Giuseppe Viale;;Pier Giuseppe Pelicci;;Pier Paolo Di Fiore.Cell,2010(1)

[5]刘丹.Erbin对Her2阳性乳腺腺癌细胞的迁移能力及赫赛汀耐药的影响及相关机制研究[D].河北医科大学,2013.