NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系的应用

背景^[1-3]

NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系该细胞是1988年11月从一名69岁白人男性（60年烟龄）非小细胞性肺腺癌淋巴结转移组织中分离得到的。

NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系

NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞培养操作

1）复苏NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

NCI-H2087人非小细胞肺腺癌贴壁细胞系可以用于GPRIN1基因在非小细胞肺癌中的作用及机制的研究

探讨GPRIN1基因在NSCLC中的表达情况,分析其与NSCLC患者临床病理特征及生存、预后的相关性。同时研究GPRIN1基因对NSCLC细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及上皮间充质转化(EMT)的影响。另外,构建NSCLC裸鼠异种移植瘤模型,检测GPRIN1对裸鼠体内移植瘤生长的影响,进一步探讨其在NSCLC中的作用机制。

研究方法部分:1、基于前期利用TCGA数据库数据阵列分析获得的GPRIN1基因表达与肺腺癌患者临床特征及生存预后关系相关数据。

2、选取100例非小细胞肺癌石蜡包埋组织标本及40例癌旁正常肺组织标本制成组织芯片。

3、通过免疫组化染色检测100例NSCLC组织及40例癌旁正常肺组织中GPRIN1的表达情况。

4、统计学分析GPRIN1在NSCLC组织及癌旁正常肺组织中的表达差异。

5、统计学分析GPRIN1表达与NSCLC患者的年龄、性别、吸烟史、TNM分期、组织分化等临床病理特征的相关性。

6、根据NSCLC患者的随访资料,分析GPRIN1表达与患者生存预后之间的相关性。

第二部分:1、体外培养人非小细胞肺癌细胞系(A549、NCI-H209、NCI-H460、Calu-1、NCI-H2087)和正常肺上皮细胞系(BEAS2B)。

2、通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qRT-PCR)检测各组细胞系中GPRIN1基因的表达情况。

3、通过免疫印迹实验(Western-blot)检测各组细胞系中GPRIN1蛋白的表达情况。

4、构建过表达GPRIN1的细胞系和低表达GPRIN1的细胞系,同时构建阴性对照组。

5、通过细胞增殖实验(CCK8)检测敲降或过表达GPRIN1对NSCLC细胞增殖能力的影响。

6、通过平板克隆实验检测敲降或过表达GPRIN1对NSCLC细胞克隆形成能力的影响。

7、通过Transwell细胞迁移及侵袭实验检测GPRIN1的敲降或过表达对NSCLC细胞迁移及侵袭能力的影响。

8、通过Western-blot实验检测GPRIN1对EMT中相关因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表达的影响。

第三部分:1、采用慢病毒载体构建GPRIN1敲除、过表达及其相应对照组的稳定表达细胞株。

2、将转染后的A549、Calu-1细胞分别接种各组裸鼠皮下,构建裸鼠皮下成瘤模型。

3、每周使用游标卡尺测量并记录各组裸鼠肿瘤长径及短径,计算肿瘤体积;并于裸鼠处死后完整剥取肿瘤进行称重。

4、通过免疫组化法检测裸鼠皮下移植瘤中Ki-67蛋白及EMT相关蛋白的表达情况。

研究结果:1、对100例NSCLC组织中GPRIN1蛋白的表达情况进行免疫组化染色分析显示,GPRIN1蛋白主要定位于NSCLC细胞的细胞膜和细胞质中。

2、GRPIN1蛋白在100例NSCLC组织中的高表达率为65%(65/100);在30例正常肺组织中的高表达率为27.5%(11/40)。表明GPRIN1蛋白在NSCLC中的表达水平高于正常的肺组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。

3、GPRIN1蛋白高表达与NSCLC患者的肿瘤分化程度相关(P<0.05),与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟状况、T分期、N分期、M分期及TNM分期无明显相关性(P>0.05)。表明GPRIN1表达水平越高,则肿瘤组织分化程度越低。

4、GPRIN1蛋白的表达水平升高预示NSCLC患者有较短总生存时间,提示高表达GPRIN1与不良预后相关(P=0.004)。

5、单因素Cox回归分析显示:GPRIN1表达水平、N分期、M分期、TNM分期与NSCLC患者的总生存时间密切相关(P<0.05),是NSCLC患者的不良预后因素。多因素Cox回归分析显示:GPRIN1表达水平、TNM分期均是NSCLC患者独立不良预后因素(P<0.05)。

参考文献

[1]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries[J].Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021(3)

[2]Lung Cancer in People’s Republic of China[J].Gao Shugeng;Li Ning;Wang Shuhang;Zhang Fan;Wei Wenqiang;Li Ni;Bi Nan;Wang Zhijie;He Jie.Journal of Thoracic Oncology,2020(10)

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[5]庄梦琪.GPRIN1基因在非小细胞肺癌中的作用及机制的研究[D].山东大学,2021.