人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞的应用

背景^[1-3]

人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞来源于一位15岁非B非T淋巴细胞性白血病患者的外周血。细胞表面抗体：CD3A(17%)、CD3B(17%)、CD3C(20%)，CD4(15%)，CD10(55%)。

人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞

人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞培养步骤

一．人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。

2）人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞处理：

1）复苏人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

悬浮细胞：将细胞瓶内液体都转移至无菌离心管内，1000转/分钟离心5min，培养基上清可备用，管底细胞沉淀用培养基重悬。镜检时若细胞密度超过80%，可将细胞悬液分至2个细胞瓶内培养；若密度未超过80%，细胞悬液移至原瓶继续培养，待达到80%时再正常传代。

备注：聚团生长慢，有密度依赖，必须使用T25培养瓶竖立培养，3天一次半量换液一次，1-2周传代一次

3）人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞可以用于葫芦素B对急性淋巴细胞白血病Reh细胞的作用及机制研究

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是淋巴母细胞恶性增殖引起的一类血液系统恶性肿瘤。与正常细胞相比,肿瘤细胞内的氧化还原平衡和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平发生变化。高水平ROS诱导的细胞凋亡和自噬是肿瘤发生发展的两种重要调控机制。葫芦素B(Cucurbitacin B,Cu B)被证实可以快速升高多种肿瘤细胞内的ROS水平,抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。然而,Cu B对ALL的作用尚未报道。本研究旨在探究Cu B对ALL细胞系Reh细胞增殖的影响,探讨其机制是否与ROS诱导细胞凋亡和自噬有关,并评估自噬与凋亡之间的相互作用。

方法:1、本实验以ALL细胞系Reh细胞为研究对象,利用MTS法检测Cu B对Reh细胞增殖的影响并确定Cu B的处理时间和给药浓度。

2、免疫荧光显微镜下观察细胞形态。

3、流式细胞术检测细胞周期、凋亡率、线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和细胞内ROS水平。

4、Western blot检测细胞周期相关蛋白cyclin B 1、凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2等、自噬相关蛋白LC3、beclin-1和P62、通路蛋白JNK和p-JNK水平。

结果:1、Cu B抑制Reh细胞增殖且呈现剂量和时间依赖性。

2、Cu B影响Reh细胞周期分布,阻滞细胞于G2/M期,而减少G1期和S期细胞百分比,并降低周期相关蛋白cyclin B1水平且呈现浓度依赖性。

3、Cu B改变Reh细胞形态,导致细胞碎裂和细胞膜皱缩。

4、Cu B诱导Reh细胞凋亡,表现为细胞凋亡率增加,DNA损伤,凋亡相关蛋白水平升高和MMP降低。

5、Cu B诱导Reh细胞自噬且不阻断自噬流,表现为LC3-I向LC3-II的转变增加,beclin-1表达增加和自噬底物P62被降解。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)预处理Reh细胞3h后,增强Cu B抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,提示Cu B诱导的自噬拮抗细胞凋亡,有助于Reh细胞存活。

6、Cu B升高Reh细胞内ROS水平且呈现浓度依赖性。ROS清除剂—N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)可以降低Cu B诱导的细胞凋亡率和自噬相关蛋白LC3水平,表明Cu B通过升高细胞内ROS水平诱导细胞凋亡和自噬。

7、20 ng/m L Cu B升高Reh细胞内JNK磷酸化水平。NAC可以降低Cu B升高的p-JNK水平,但是,JNK通路抑制剂SP600125未明显降低Cu B诱导的细胞凋亡率,表明ROS激活的JNK信号通路不是Cu B诱导细胞凋亡所必需的。

结论:Cu B通过阻滞细胞于G2/M期和诱导细胞凋亡抑制Reh细胞生长,并且诱导细胞保护性自噬。细胞凋亡和自噬是由Cu B升高细胞内ROS水平引起的。

参考文献

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[5]李慧.葫芦素B对急性淋巴细胞白血病Reh细胞的作用及机制研究[D].南华大学,2022.