人正常前列腺上皮细胞的应用

背景^[1-3]

人正常前列腺上皮细胞来自一位54岁白人男性的正常前列腺组织切片的周围区域的上皮细胞用单拷贝的人乳头瘤病毒18（HPV-18）进行转化，建立了RWPE-1。据报道，RWPE-1细胞在三维Matrigel培养时，在雄激素刺激下，形成腺胞（acini）并向培养基中分泌PSA。当与Matrigel或基质细胞混合注射雄性裸鼠时，RWPE-1细胞也能形成腺胞并产生PSA。

人正常前列腺上皮细胞

来源于RWPE-1的细胞用Kirstin鼠肉瘤病毒（Ki-MuSV）转染Ki-ras基因，建立了能成瘤的RWPE-2细胞和RWPE2-W99细胞。

另外，用N-甲醇-N-硝基脲（MNU）处理RWPE-1，建立了一系列模拟前列腺癌进程中不同时期的成瘤细胞株。它们分别是WPE1-NA22,WPE1-NB14,WPE1-NB11和WPE1-NB26细胞。据报道，RWPE-1细胞经过检测后发现乙肝病毒、丙肝病毒和人免疫缺陷病毒都呈阴性。PCR证实该细胞系HPV病毒DNA序列呈阳性。

人正常前列腺上皮细胞培养步骤：

1）复苏人正常前列腺上皮细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）人正常前列腺上皮细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于人正常前列腺上皮细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人正常前列腺上皮细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打人正常前列腺上皮细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

3）人正常前列腺上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。

应用^[4][5]

人正常前列腺上皮细胞可以用于阴离子通道CFTR在双酚A致前列腺细胞恶性转化的潜在作用研究

探究CFTR在BPA对人正常前列腺细胞的影响中的潜在机制。本研究有助于揭示环境内分泌干扰物的致生殖系统相关肿瘤的机制,促进开发防癌治癌的药物或技术。

方法:首先通过CCK-8确定BPA对人正常前列腺上皮细胞的染毒浓度及时间;在适当浓度和时间的BPA作用下,通过划痕实验、软琼脂克隆实验及Transwell小室实验测定前列腺上皮细胞的增殖、迁移及侵袭力;用ELISA法和Western Blotting蛋白印迹法分别检测BPA处理后的前列腺细胞的ATP及CFTR、Bcl-2、Bax的含量;用流式细胞仪检测BPA作用后的各组细胞的凋亡水平。

利用SPSS通过单因素方差分析及析因设计方法分析数据,定量数据用平均值±标准差表示,p<0.05为差异有统计学意义。结果:CCK-8的结果显示,RWEP-1细胞的活性与BPA的浓度呈非线性关系。

在0μM-10μM浓度范围内,BPA作用24 h后,细胞活性无明显变化。当浓度大于10μM时,细胞活性明显下降。经绘制生长曲线后计算出IC50为160μM。毒理学上通常取毒物IC50的八分之一作为染毒浓度,因此在本研究中BPA的最适染毒浓度为20μM。在最适BPA浓度下RWPE-1细胞细胞活性与时间无明显关联。20μM BPA染毒48 h后细胞的凋亡水平无明显差异。

以上实验说明20μM此浓度对细胞无急性损伤作用且不会改变其凋亡水平,浓度合适。在最适浓度BPA染毒4周后得到染毒细胞株。与对照组相比,软琼脂克隆实验、划痕实验及Transwell小室实验发现染毒之后的细胞克隆能力、迁移能力及侵袭能力,其各项能力均显著增强。染毒后细胞内ATP水平明显降低;BPA染毒后的人正常前列腺上皮细胞内CFTR和Bax水平显著降低,而Bcl-2蛋白表达水平明显增加。

结论:(1)BPA能诱导人正常前列腺上皮细胞发生恶性转化。

(2)BPA可能通过抑制阴离子通道CFTR的表达致线粒体功能障碍并抑制细胞凋亡而诱导人正常前列腺上皮细胞恶性转化。

参考文献

[1]Perinatal exposure to Bisphenol A disturbs the early differentiation of male germ cells[J].Pagotto Romina;Santamaría Clarisa G.;Belén Harreguy María;Abud Julián;Zenclussen María Laura;Kass Laura;Crispo Martina;Mu?oz de Toro Mónica M.;Rodriguez Horacio A.;Bollati Fogolín Mariela.Reproductive Toxicology,2020(prep)

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[3]Efficiency of selected wastewater treatment processes in removing estrogen compounds and reducing estrogenic activity using the T47D-KBLUC reporter gene assay[J].Muyasu Grace Kibambe;;Maggie N.B.Momba;;A.P.Daso;;M.C.Van Zijl;;Marthie A.A.Coetzee.Journal of Environmental Management,2020(C)

[4]Cancer statistics,2020.[J].Siegel Rebecca L;;Miller Kimberly D;;Jemal Ahmedin.CA:a cancer journal for clinicians,2020(1)

[5]刘佳.阴离子通道CFTR在双酚A致前列腺细胞恶性转化的潜在作用研究[D].桂林医学院,2021.