小鼠淋巴细胞白血病的应用

背景^[1-3]

小鼠淋巴细胞白血病是由G.Moore等（1966）和P.Himmelfarb等（1967）报导。此细胞系广泛用于化学因子和天然产物细胞毒活性的常规筛选。接种裸鼠在21天内100%（5/5）成瘤。

小鼠淋巴细胞白血病

小鼠淋巴细胞白血病细胞培养条件：

1、大小鼠淋巴细胞白血病细胞培养基：RPMI-1640培养基（不含Hepes）+10%胎牛血清+1%双抗+800ng/ml Taxol

2、温度：37.0°C

3、气体:空气95%，CO2 5%

小鼠淋巴细胞白血病细胞培养步骤：

一、小鼠淋巴细胞白血病细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

二、小鼠淋巴细胞白血病细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

a）、对于小鼠淋巴细胞白血病细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗小鼠淋巴细胞白血病细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

3.轻轻吹打小鼠淋巴细胞白血病细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将JeKo-1细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

三、小鼠淋巴细胞白血病细胞冻存：

1、小鼠淋巴细胞白血病细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待小鼠淋巴细胞白血病细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3、用适量的冻存液重悬小鼠淋巴细胞白血病细胞，并放置于冻存管中；

4、先将小鼠淋巴细胞白血病细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃。

应用^[4][5]

小鼠淋巴细胞白血病可以用于AS2O3对L1210细胞增殖、凋亡及自噬的影响

将As2O3应用于治疗M3型急性早幼粒细胞白血病(APL),之后又发展到治疗维甲酸治疗缓解后复发的M3型患者,完全缓解率达93%以上,已被公认为M3型白血病治疗首选药物。一般认为As2O3治疗APL的主要机制是诱导白血病细胞凋亡,很少考虑其对细胞自噬的影响。

本研究从As2O3对L1210细胞增殖、凋亡及自噬的影响,探讨其抗白血病的更可能的隐藏机制。本研究采用MTT法及Brdu-Elisa法测定不同浓度As2O3对L1210细胞增殖的影响,流式细胞术及AO/EB双染法检测细胞凋亡,AO染色及MDC染色检测细胞自噬,免疫印迹法检测增殖相关蛋白PCNA、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、自噬相关蛋白LC3B的表达。

另用苯诱导的小鼠再生障碍性贫血模型检测As2O3是否能刺激骨髓细胞的造血功能。

细胞实验结果显示:As2O3对L1210白血病细胞呈剂量、时间依赖性生长抑制作用,24h、48h、72h半数抑制浓度(IC50)分别为11.61μmol/L±0.05、3.34μmol/L±0.03、0.13μmol/L±0.08。As2O3作用24h,细胞凋亡率随着As2O3浓度的升高而升高,5、10、20μmol/L的凋亡率分别为26.52%±0.02、30.99%±0.06、74.48%±0.05。AO/EB双染法可观察到细胞形态发生明显变化,如细胞核浓缩、凋亡细胞表面膜出泡、体积变小、细胞破裂并出现凋亡小体等形态学特征,并呈剂量依赖性。AO染色及MDC染色可观察到自噬阳性显色,且药物浓度越高,阳性率越高。

Western-blot结果显示:As2O3能上调自噬相关蛋白LC3B、促凋亡蛋白BAX的表达水平,使细胞增殖相关蛋白PCNA、抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达下降,并程剂量依赖性。体内实验表明,As2O3能使再障小鼠外周血细胞数量、骨髓细胞数量、网织红细胞绝对值、血红蛋白含量增高,改善肝、肾组织的损伤情况。

综上所述,As2O3通过诱导L1210细胞凋亡及自噬的产生来达到治疗淋巴细胞白血病,能刺激再障小鼠骨髓细胞的造血功能。

参考文献

[1]Essential Role for the Mammalian ATG8 Isoform LC3C in Xenophagy[J].Tomer Shpilka;;Zvulun Elazar.Molecular Cell,2012(3)

[2]Zymophagy:Selective Autophagy of Secretory Granules[J].Maria I.Vaccaro;;Fulvio Reggiori.International Journal of Cell Biology,2012

[3]Microautophagy in mammalian cells:Revisiting a 40-year-old conundrum[J].Dalibor Mijaljica;;Mark Prescott;;Rodney J.Devenish.Autophagy,2011(7)

[4]Programmed Cell Death in Animal Development and Disease[J].Yaron Fuchs;;Hermann Steller.Cell,2011(4)

[5]李鸿儒.AS2O3对L1210细胞增殖、凋亡及自噬的影响[D].河南大学,2015.