DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒的应用

背景^[1-3]

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒是一种借助辣根过氧化物酶(HRP)，用于免疫组化显色、原位杂交显色或Western、Southern、Northern、EMSA等膜显色的试剂盒。

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

DAB，即3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride，是辣根过氧化物酶的常用底物。在辣根过氧化物酶的催化下，DAB会产生棕色沉淀。该棕色沉淀不溶于水和乙醇。因此在DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒可以用于细胞或组织在免疫组化或原位杂交时结合的辣根过氧化物酶显色，也可以用于Western等结合有辣根过氧化物酶的膜的显色检测。同时也可以用于细胞或组织内源性的辣根过氧化物酶显色。

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒操作步骤：

1、常规组织切片、细胞样品、膜与辣根过氧化物酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。对于检测内源性辣根过氧化物酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也可用洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

2、按(A):试剂(B):试剂(C)=5000:5000:3的比例混合,即为DAB染色工作液，即配即用。

3、洗涤过组织后，去除洗涤液，加入适量DAB染色工作液，确保覆盖样品。

4、室温避光孵育30min或更长时间，直至显色至预期深浅。

5、去除DAB染色工作液，用蒸馏水清洗1～2次即可终止显色反应。

6、对组织切片或细胞样品，反应终止后，如有必要可用中性红染色液染色，便于观察。对于膜染色，反终止后可室温晾干避光保存。

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒常见问题及可能原因：

1、背景显色太深

①在免疫组化时如果背景显色太深，考虑使用适当的封闭液进行封闭，例如选购适当的封闭液或使用和一抗相同来源的血清(10%)进行封闭。也应请注意选购经过适当吸附的二抗，以减小二抗的非特异性吸附。

②在进行含内源性过氧化氢酶的免疫组化时，如果背景显色太深，需注意灭活内源性过氧化氢酶。可以在4体积甲醇中加入1体积3%过氧化氢，混匀后用于内源性过氧化氢酶的灭活。

③可以考虑缩短显色时间，或降低二抗浓度。

④选择适当强度的洗涤液，或延长洗涤时间。

2、没有显色或显色太弱

①当提高一抗或二抗的浓度。检测二抗效果，滴一滴稀释二抗在膜上，检测二抗是否可以被正常显色。

②考虑使用更加灵敏的放大检测体系，例如使用生物素检测体系。

③适当延长显色时间，另外确定抗原修复是否对于使用的一抗是必需的。

应用^[4][5]

DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒可以用于辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的制备及其在免疫分析中的应用

辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的及其抗体复合物制备过程,并以乙肝表面抗原为检测模型进行实际应用。

通过油包水(W/O)型微乳体系,制备了直径为50±5 nm的二氧化硅纳米颗粒,以此为载体,制备了抗体-酶-硅纳米颗粒复合物。通过氨基硅烷修饰在硅纳米颗粒的表面引入氨基,然后利用高碘酸钠氧化法将HRP标记在颗粒表面,最后通过氧化葡聚糖的桥接作用将乙肝表面的抗体分子标记到酶标记的纳米颗粒表面。考察了三种不同氨基硅烷对于HRP标记效率的影响,利用免疫分析的效果来考察HRP和抗体分子不同的用量对于酶标记二氧化硅纳米颗粒-抗体复合物标记效果的影响。

最后在的条件下检测乙肝表面抗原,其灵敏度达到0.06 ng/mL,线性范围0.15-12.5 ng/mL,对260份血清样品的检测结果与传统的ELISA完全一致,对30份阳性血清样品的检测结果与传统ELISA相关性良好,相关系数r为0.992。

辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒在氯霉素检测中的应用,在这一章中通过检测小分子药物氯霉素的实验来考察辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒在竞争型ELISA中应用的可行性。

实验中,采用了三种不同的免疫分析策略以及两种氨基硅烷制备的酶标记物对氯霉素进行检测。该方法对氯霉素检测的灵敏度最低可以达到0.012 ng/mL,而且线性良好。

以最终选定的策略和标记物进行回收率实验,回收率在85.01%-101.23%之间,CV在6.89%-25.66%,而且与传统的ELISA相关性良好。

综上所述,提出了一种基于二氧化硅纳米颗粒的新型酶标记物及其制备方法。实验证明,与传统的直接将酶分子标记到抗体(或抗原)分子的方法相比,该方法具有操作灵活,过程可控,重复性高,纯化容易,且具有一定的信号放大能力的优点。因此,该标记方法具有极大的应用价值。

参考文献

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[4]Point-of-care-testing and Clinical Governance[J].Joan Pearson.Clinical Chemical Laboratory Medicine,2006(6)

[5]柯荣秦.辣根过氧化物酶标记二氧化硅纳米颗粒的制备及其在免疫分析中的应用[D].厦门大学,2008.