AKT inhibitor VIII (Akt抑制剂)

背景^[1-7]

AKT inhibitor VIII(AKTi-1/2)是一种细胞渗透的喹喔啉化合物，能够有效的，选择性的，可逆的抑制Akt1，Akt2和Akt3的活性，IC50值分别为58 nM，210 nM和2119 nM。蛋白激酶B（PKB），也称为Akt，是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在多种细胞过程中起关键作用，例如葡萄糖代谢，细胞凋亡，细胞增殖，转录和细胞迁移。

Akt1通过抑制细胞凋亡过程参与细胞存活途径。Akt1还能够诱导蛋白质合成途径，因此是细胞途径中的关键信号蛋白，其导致骨骼肌肥大和一般组织生长。完全缺失Akt1的小鼠模型表现出生长迟缓和组织例如睾丸和胸腺中的自发细胞凋亡增加。由于它可以阻断细胞凋亡，从而促进细胞存活，因此Akt1被认为是许多类型癌症的主要因素。

Akt（现在也称为Akt1）最初被鉴定为转化逆转录病毒AKT8中的致癌基因。Akt2是胰岛素信号传导途径中的重要信号分子。需要诱导葡萄糖转运。在对Akt1无效但对Akt2正常的小鼠中，葡萄糖稳态不受干扰，但动物较小，与Akt1在生长中的作用一致。相反，没有Akt2但具有正常Akt1的小鼠具有轻微的生长缺陷并且显示出糖尿病表型（胰岛素抗性），这再次与Akt2对胰岛素受体信号传导途径更具特异性的观点一致。Akt同种型在多种人类肿瘤中过表达，并且在基因组水平上，在胃腺癌（Akt1），卵巢（Akt2），胰腺（Akt2）和乳腺（Akt2）癌症中被扩增。

Akt3的作用不太清楚，尽管它似乎主要在大脑中表达。据报道，缺乏Akt3的小鼠有小脑。当用AKT抑制剂VIII预处理LnCaP细胞然后与TRAIL一起温育时，观察到胱天蛋白酶-3活性的显着增加（相对于对照或单独的TRAIL为6-10倍）。用AKT抑制剂VIII对肿瘤细胞系的这种致敏作用不限于LnCaP细胞，因为在HT29，MCF7和A2780细胞中观察到类似的细胞凋亡诱导，以及化学增敏剂如喜树碱，赫赛汀和多柔比星。通过Akt抑制剂VIII预处理增强了呋喃二烯诱导的p-Akt和Akt表达的减少。

此外，通过Akt抑制剂VIII预处理增强了呋喃二烯诱导的PARP裂解。Akt抑制剂VIII对切割的PARP表达没有影响，但降低了p-Akt和Akt的表达。AKT抑制剂VIII降低细胞活力，并增加磷脂酰丝氨酸（PS）易位至质膜外叶，DNA片段化，Caspase-9裂解，Caspase-3活化和PARP蛋白水解在hESC细胞系WA01（H1）和WA09（H9）和在我们实验室产生的hiPSCs细胞系中（FN2.1）。给予小鼠AKT抑制剂VIII，使血浆浓度为1.5-2.0μM，然后给动物尾静脉注射IGF以刺激Akt磷酸化。通过IP Western，基础和IGF刺激的Akt1和Akt2磷酸化在小鼠肺中受到抑制，对Akt3磷酸化没有影响。

研究应用^[8]

AKT抑制剂对鼻咽癌细胞株CNE1的放疗增敏作用。

方法：CCK8法检测不同浓度124005对人鼻咽癌CNE1细胞的抑制作用,计算IC50值,选择低于IC50的药物浓度作为增敏浓度。集落形成实验检测放射线加或不加124005以及124005+放射线组联合或不联合自噬抑制剂3-MA对CNE1细胞生存曲线的影响。间接免疫荧光法检测γ-H2AX观察DNA损伤修复和GFP-LC3转染CNE1中自噬标志物LC3的聚集。流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡。免疫印迹法(Western blot)检测Caspase-3、PARP、Beclin 1和LC3-Ⅱ的表达,并检测AKT及下游信号通路的表达,探索Akt抑制剂124005放射增敏效应及其潜在机制。

结果：124005对CNE1 IC50值为30.5μmol/L。集落形成实验显示,DEF值放疗+8μmol/L 124005持续用药组为1.92,放疗+12.5μmol/L 124005用药72 h组为1.12,共聚焦显微镜观察显示124005联合放疗显著增加了CNE1细胞照射后细胞核内γ-H2AX焦点的聚集和转染GFP-LC3质粒的CNE1细胞内LC3的点状聚集。流式检测124005可以明显提高放射线诱导的CNE1细胞凋亡,凋亡率最高达52.9%。

Western blot显示124005可以显著抑制放射后p-AKT及下游p-GSK-3β和p-PRAS40的表达,增加放射引起的cleaved caspase-3和cleaved PARP以及Beclin1和LC3-Ⅱ的表达。应用3-MA可降低124005处理后LC3-Ⅱ的表达水平。放射+124005再联用3 mmol/L 3-MA组的DEF值为1.69,明显低于单纯放射+124005组(DEF=1.97)。结论24005通过对AKT以及下游通路的抑制,抑制DNA损伤修复,同时增加凋亡和自噬来起到对CNE1细胞株放射增敏的效应。

参考文献

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