人结直肠腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人结直肠腺癌细胞是LS 180(ATCC CL 187)结肠腺癌细胞株的胰蛋白酶化变种。它比亲本更易传代，象LS 180一样生成大量的癌胚抗原(CEA)。电镜研究表明有丰富的微丝和细胞质粘液素液泡。直肠抗原3阳性。p53抗原表达阴性，但mRNA表达阳性。与ATCC CL-187来源于同一个肿瘤。LS 174T细胞角蛋白染色阳性。癌基因c-myc,N-myc,H-ras,N-ras,Myb,和fos的表达呈阳性。癌基因k-ras和sis的表达未做检测。

人结直肠腺癌细胞

一．人结直肠腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备MEM培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）人结直肠腺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）人结直肠腺癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．人结直肠腺癌细胞处理：

1）冻存人结直肠腺癌细胞的复苏：：

将含有1mL人结直肠腺癌细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察人结直肠腺癌细胞生长情况和细胞密度。

2）人结直肠腺癌细胞传代：如果人结直肠腺癌细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人结直肠腺癌细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人结直肠腺癌细胞1-2次。

2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人结直肠腺癌细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持人结直肠腺癌细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3）人结直肠腺癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1.人结直肠腺癌细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般人结直肠腺癌细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.

2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬人结直肠腺癌细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3.将要冻存的人结直肠腺癌细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人结直肠腺癌细胞可以用于结直肠腺癌中CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞与MVD的相关性

检测CD163、巨噬细胞、CD8+T细胞、CD34在结直肠腺癌中的表达,并探讨CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、微血管密度(Microvascular Density,MVD)的相关性及与患者临床病理因素的关系。研究潜在的针对结直肠癌微环境的抗血管生成治疗的可能性,旨在为探索新的抗肿瘤治疗方法提供线索。

[方法]收集2016年8月-2019年9月期间原发性结直肠腺癌根治性标本61例,将癌组织设为实验组,相应的远癌组织(距离癌组织5cm以上)设为对照组。收集并整理该61例患者的临床病理资料,根据性别、年龄、肿瘤生长部位、TNM分期、有无淋巴结转移、有无远处转移进行分组。通过免疫组化染色方法检测CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、CD34在结直肠腺癌中的表达情况,运用SPSS26.0统计学软件对所得实验数据进行统计分析,研究CD163+巨噬细胞、CD8+T细胞、MVD表达的相关性及与患者临床病理因素的关系。

[结果]CD163、CD8、MVD在癌组织及非癌组织中的表达具有显著差异(p<0.01)。CD163与MVD的表达具有显著正相关性(p<0.001);CD8与MVD的表达具有负相关性(p=0.012);CD8与CD163的表达具有显著负相关性(p=0.003)。CD163+巨噬细胞与结直肠腺癌分化程度、淋巴转移、远处转移、TNM分期相关(p<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤的位置无关(p>0.05)。MVD与结直肠腺癌肿瘤位置、分化程度、淋巴转移、远处转移、TNM分期相关(p<0.05),与患者性别、年龄无关(p>0.05)。CD8+T细胞与结直肠腺癌患者性别、年龄、肿瘤位置、分化程度、TNM分期、淋巴转移、远处转移均无关(p>0.05)。

[结论]结直肠腺癌中,CD163+巨噬细胞与肿瘤微血管密度之间具有显著正相关性,且与肿瘤的侵袭和转移密切相关。CD8+T细胞与肿瘤微血管密度之间具有负相关性,CD8+T细胞可能在抑制血管生成方面起到一定作用。CD163+巨噬细胞与CD8+T细胞之间具有显著负相关性,TAMs可能对CD8+T细胞具有拮抗作用。联合靶向消除TAMs及促进CD8+T细胞活化与增殖可能对结直肠癌的抗血管生成治疗产生一定意义。

参考文献

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[2]Immunotherapy Potentiates the Effect of Chemotherapy in Metastatic Melanoma-A Retrospective Study.[J].Hadash-Bengad Reut;;Hajaj Emma;;Klein Shiri;;Merims Sharon;;Frank Stephen;;Eisenberg Galit;;Yakobson Alexander;;Orevi Marina;;Caplan Nadia;;Peretz Tamar;;Lotem Michal;;Cohen Jonatan E.Frontiers in oncology,2020

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[4]Macrophages and Metabolism in the Tumor Microenvironment[J].Ilio Vitale;;Gwenola Manic;;Lisa M.Coussens;;Guido Kroemer;;Lorenzo Galluzzi.Cell Metabolism,2019(1)

[5]蔡秋莉.结直肠腺癌中CD163~+巨噬细胞、CD8~+T细胞与MVD的相关性[D].昆明医科大学,2021.