人B淋巴瘤细胞系的应用

背景^[1-3]

人B淋巴瘤细胞系源于一名患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL）白人女性的活检淋巴组织，由HBen-Bassat建系。经IL-4处理，该细胞CD21,CD22,CD54和CD58表达上调，而CD21,CD22,andCD38表达下调。

人B淋巴瘤细胞系

人B淋巴瘤细胞系细胞培养操作

1）复苏人B淋巴瘤细胞系细胞：将含有1mL人B淋巴瘤细胞系细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有人B淋巴瘤细胞系细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人B淋巴瘤细胞系细胞传代：如果人B淋巴瘤细胞系细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人B淋巴瘤细胞系细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若人B淋巴瘤细胞系细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人B淋巴瘤细胞系细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人B淋巴瘤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.人B淋巴瘤细胞系细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml人B淋巴瘤细胞系细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人B淋巴瘤细胞系可以用于Syk在人B淋巴瘤细胞中的表达及作用机理研究

Syk(Spleen Tyrosine Kinase)是一种非受体蛋白酪氨酸激酶,广泛表达于造血细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞,在细胞信号转导中发挥着重要作用。Syk基因被认为是候选抑癌基因,对肿瘤的生长和转移有抑制作用。

本研究中,我们对Syk基因在B淋巴瘤细胞中的表达及Syk基因启动子区5’CpG岛的甲基化情况进行了研究,初步探讨了Syk在B淋巴瘤细胞中的作用机理。

方法:1应用免疫组化S-P法和Western-blot方法检测了人B淋巴瘤细胞株(Raji、Namalwa和Ramos)中Syk蛋白表达水平。

2用RT-PCR方法检测Raji、Namalwa和Ramos细胞中Syk基因的表达。

3 5-aza-CDR对B淋巴瘤细胞株的增殖、周期和凋亡情况的检测:用含5-aza-CdR处理Raji和Ramos细胞后,经MTT实验、流式细胞技术、DNA凝胶电泳和电子显微镜观察,分析了5-aza-CDR对B淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。

4 B淋巴瘤细胞中Syk基因甲基化状态检测:提取Raji和Ramos细胞DNA,经亚硫酸盐修饰纯化后,行甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测Syk启动子区的甲基化情况。

结果:1经抗Syk抗体免疫组化染色,Syk蛋白阳性反应为棕黄色颗粒,定位于细胞浆;胞浆不着色,视为阴性。Namalwa和Raji细胞中syk表达阳性,Ramos细胞syk表达阴性。Western-blot检测结果显示,Namalwa和Raji细胞表达syk,Ramos细胞中syk表达缺失。

2用RT-PCR方法检测结果显示,Ramos细胞中未检测到syk mRNA表达;Namalwa和Raji细胞中syk mRNA表达阳性。

3 Raji和Ramos细胞在去甲基化试剂5-aza-CdR作用下细胞增殖明显受到抑制。不同浓度5-aza-CdR(终浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μM)作用96小时,均可明显抑制细胞的增殖(P<0.05),并具有剂量依赖性;用不同浓度的5-aza-CDR(0μm/L,0.1μm/L,0.5μm/L,1μm/L,2μm/L和5μm/L)处理后,Raji和Ramos细胞出现明显的细胞凋亡现象(P<0.05),随着剂量的增加凋亡率明显增加(P<0.05);但细胞周期未见明显改变。

4 MSP结果示,Raji和Ramos细胞Syk基因启动子区未见甲基化现象。

参考文献

[1]Syk and Slp-76 Mutant Mice Reveal a Cell-Autonomous Hematopoietic Cell Contribution to Vascular Development[J].Eric Sebzda;;Chris Hibbard;;Shawn Sweeney;;Farhad Abtahian;;Natalie Bezman;;Gina Clemens;;Jonathan S.Maltzman;;Lan Cheng;;Feiyan Liu;;Martin Turner;;Victor Tybulewicz;;Gary A.Koretzky;;Mark L.Kahn.Developmental Cell,2006(3)

[2]Reduced expression of the Syk gene is correlated with poor prognosis in human breast cancer[J].Tatsuya Toyama;;Hirotaka Iwase;;Hiroko Yamashita;;Yasuo Hara;;Yoko Omoto;;Hiroshi Sugiura;;Zhenhuan Zhang;;Yoshitaka Fujii.Cancer Letters,2003(1)

[3]DNA hypermethylation in tumorigenesis:epigenetics joins genetics[J].Stephen B Baylin;;James G Herman.Trends in Genetics,2000(4)

[4]Tyrosine kinase SYK:essential functions for immunoreceptor signalling[J].Martin Turner;;Edina Schweighoffer;;Francesco Colucci;;James P Di Santo;;Victor L Tybulewicz.Immunology Today,2000(3)

[5]彭华.Syk在人B淋巴瘤细胞中的表达及作用机理研究[D].河北医科大学,2007.