人肝星形细胞的应用

背景^[1-3]

人肝星形细胞由发表该细胞文章的作者命名，这个细胞又叫Lieming Xu-2，这是一个永生化的细胞。肝星形细胞在慢性酒精中毒、乙型和丙型肝炎、脂肪性肝病、肥胖和糖尿病等疾病中扮演重要角色，激活后为肌成纤维细胞，是负责肝纤维化的主要细胞类型。人肝星形细胞LX-2细胞系是2004年取HSC细胞转染SV40大T抗原而建立的永生化细胞系。因此人肝星形细胞LX-2保留了肝星状细胞信号传导、神经元基因表达、视黄醇代谢和纤维化形成的关键特性，如表达βPDGF-R，Ob-RL，DDR2等，是非常适合研究人类肝纤维化的模型。

人肝星形细胞

人肝星形细胞LX-2呈上皮细胞样，多角形，贴壁生长，倍增时间3-4天。能够在血清浓度极低(1%FBS)的条件下生长，并具有高转染性，使用TGF-β1可诱导LX-2细胞转为化肌成纤维细胞。该细胞经STR鉴定结果无误，且支原体检测阴性。

人肝星形细胞培养操作

1）复苏人肝星形细胞：将含有1mL人肝星形细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将人肝星形细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人肝星形细胞传代：如果人肝星形细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察人肝星形细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人肝星形细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人肝星形细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.人肝星形细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬人肝星形细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人肝星形细胞可以用于细胞自噬在肝星形细胞纤维化中的作用原发性胆汁性胆管炎血脂异常特点

探讨细胞自噬、TGF-β1与人肝星形细胞系LX-2纤维化之间的关系。

研究方法LX-2经含10%FBS的DMEM完全培养基培养并传代,经不同处理方法培养:

(1)DMEM完全培养基与LX-2共培养48小时(h),收集0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48hLX-2。

(2) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与LX-2共培养48h,收集0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h、36h、48hLX-2。

(3) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与LX-2共培养48h,分别在20h加自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycinAl,BA1)至终浓度为3nmol/L、10nmol/L,氯喹(Chloroquine,CQ)至终浓度为10umol/L、30umol/L,3-甲基嘌呤(3-methyladenine,3-MA)至终浓度为300umol/L、1000umol/L,于48h收集LX-2。

(4) DMEM完全培养基中与LX-2共培养48h,分别在20h加BA1至终浓度为10 nmol/L,CQ至终浓度为30 umol/L,于48h收集LX-2。

(5) 加入TGF-β1至终浓度为10 ng/ml与LX-2共培养48h,在20 h将DMEM完全培养基换成平衡盐溶液饥饿LX-2激活自噬4 h,此时收取LX-2细胞蛋白样品,同时换成完全培养基继续培养至TGF4 1加入后的48h,收取蛋白样品检测。

(6) Western Blotting方法检测其不同处理组微管相关蛋白轻链3 B-II(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和alpha-SMA的蛋白表达量。

(7) RT-PCR方法检测各组Fibronectin和alpha-SMA基因的相对表达量。

结果(1)LX-2在基础状态下有低水平自噬,随着培养时间延长越明显,而Fibronectin和alpha-SMA蛋白表达量无明显变化。

(2) TGF-β1刺激后LX-2自噬在3h开始出现,24h开始达峰,48小时减弱;Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随时间延长逐渐增多,48h增多明显。

(3) TGF-β1刺激并抑制自噬后高浓度BA1和CQ组LC3B-II蛋白表达量增力口,加入自噬早期抑制剂3-MA后LC3B-II蛋白含量明显减少,Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随着自噬抑制而增加。

(4) 正常培养条件下抑制自噬后LC3B-II蛋白表达量增加,Fibronectin和alpha-SMA的蛋白表达量随着自噬抑制而增加。

(5) TGF-β1刺激后,饥饿诱导自噬LC3B-II蛋白含量明显增加,Fibronectin和alpha-SMA蛋白的表达量随着自噬激活而减少。

(6)TGF-β1刺激组较基础状态组Fibronectin和alpha-SMA基因相对表达量明显升高,差异有统计学意义,(p<0.01);TGF-β1+BA1组、TGF-β1+CQ组和TGF-β1+3-MA组、TGF-β1+饥饿组与TGF-β1组相比Fibronectin和alpha-SMA基因相对表达量明显无明显差异。

参考文献

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[5]邵体红.细胞自噬在肝星形细胞纤维化中的作用原发性胆汁性胆管炎血脂异常特点[D].北京协和医学院,2018.