人子宫颈表皮癌细胞的应用

背景^[1-3]

人子宫颈表皮癌细胞是J.Sykes于1974年建立的（参考ATCC HTB-33）。有报告称MS751细胞含有人乳头状瘤病毒18(HPV-18)序列。后来发现MS751细胞包含HPV-45基因组的一部分，而其中E6/E7区域表达呈poly(A)+RNA的形式。

人子宫颈表皮癌细胞

人子宫颈表皮癌细胞特性

1)来源：宫颈表皮样癌淋巴结转移灶

2)形态：上皮细胞样

3)含量：>lxl06个/mL

4)污染：支原体、细菌、酵母和真菌检测为阴性

5)规格：T25瓶或者lmL冻存管包装

人子宫颈表皮癌细胞培养步骤

1)人子宫颈表皮癌培养基及培养冻存条件准备：

1.准备MEM培养基(MEM,GIBCO,货号41500034，添加NaHC03 1.5g八，丙酮酸钠O.llg八)，90%;优质胎牛血清，10%。

2.培养条件：气相：空气，95%;二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3.冻存液：90%完全培养基，10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2)人子宫颈表皮癌细胞处理：

复苏人子宫颈表皮癌细胞：将含有lmL细胞悬液的冻存管在37°C水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加l-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入l〇cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

人子宫颈表皮癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。力口2m丨消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培养瓶中，置于37°C培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加l-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

人子宫颈表皮癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约lml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加1〇%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人子宫颈表皮癌细胞可以用于细胞外分泌蛋白CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈组织中的表达和宫颈癌细胞中的作用机制研究

分析CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈组织的表达和宫颈癌细胞中的功能以探讨CTHRC1在HPV16/18阳性宫颈癌发生发展中的分子机制,以期CTHRC1成为一个新的宫颈癌诊断和预后评估的生物标志物以及宫颈癌治疗的新靶点。

方法(1)对1万名妇女进行宫颈HPV分型检测,确定受检人群高危型HPV分布的特点及高危因素,分析研究人群中宫颈癌及癌前病变患者的高危型HPV分布特点。

(2) 利用RNA干扰技术,基因芯片技术及生物信息学分析技术分析宫颈癌细胞中显著受HPV16/18E6/E7调控的细胞外分泌蛋白,并进一步在宫颈癌数据库网络中进行验证。

(3) 用RT-PCR法比较HPV16/18阳性的宫颈组织和HPV阴性的宫颈组织之间,HPV16/18阳性的宫颈炎,CIN和宫颈癌组织之间CTHRC1的表达差异；用免疫组化法分析CTHRC1在宫颈癌,CIN和正常对照的差异,分析CTHRC1的表达与宫颈鳞癌临床病理特征之间的关系。

(4) 构建过表达和稳转干扰慢病毒载体和纯化的CTHRC1蛋白,分别检测其对HPV16/18阳性的宫颈癌细胞的增殖,侵袭,迁移和化疗抵抗的影响,利用CTHRC1单克隆抗体检测其对纯化蛋白处理宫颈癌细胞的迁移功能影响。

(5) 构建荧光素酶基因报告系统,检测CTHRC1对宫颈癌Wnt经典通路和非经典通路的影响,并利用磷酸化信号通路芯片检测CTHRC1对Wnt经典通路和非经典通路下游基因的影响。

(6) 用ELISA法检测CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈癌和癌前病变患者血清中的浓度,分析血清CTHRC1浓度评估宫颈癌的临床诊断价值。

结果(1)1万名妇女中宫颈高危型HPV分布由高到低依次为HPV52、16、58、18和33,其中CIN及宫颈癌患者的HPV类型也主要是HPV16,52和18。

(2) HPV16/18阳性的宫颈癌细胞中显著受E6/E7的转录调控的微环境相关的细胞外分泌蛋白前五位依次是GTF2I,INSL6,BIRC3,PTN,CTHRC1,其中CTHRC1与多种肿瘤的发展相关,我们进一步验证了其与宫颈癌的相关性,确定其为研究的目的基因。

(3) 免疫组化染色的结果显示,CTHRC1在宫颈鳞癌和宫颈腺癌组织中的高表达率分别为50.49%和68.96%,明显高于正常组织(鳞状上皮3.33%,腺上皮6.67%)及CIN组织21.0%的高表达率(P<0.0001,P<0.0001,0.0181)；在宫颈鳞癌组织中,CTHRC1的表达与肿瘤的临床分期(p=0.0021)、肿瘤细胞的级别(p=0.0186),淋巴结转移(p=0.0075),淋巴脉管浸润(p=0.0010),肿瘤的直径(P<0.0001)和宫颈基质的浸润深度(p=0.0001)均显著相关,随着临床分期的增加,肿瘤级别的升高,有淋巴结转移和淋巴脉管的浸润,肿瘤直径>4cm和宫颈基质浸润深度>1/2者,CTHRC1的高表达率显著增加。

(4) 划痕实验显示,与对照组比较,CTHRC1过表达细胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1蛋白直接处理细胞均能明显促进细胞迁移,CTHRC1稳转干扰细胞均能明显抑制细胞迁移,差异均有显著性(p值均<0.01)。

空穿和胶穿实验显示,CTHRC1过表达细胞穿出transwell小室细胞数明显多于对照组,差异有显著性(p值均<0.001),CTHRC1稳转干扰细胞穿出transwell小室数明显少于对照组,差异有显著性(p值均<0.001)。空穿实验还显示,CTHRC1蛋白处理后细胞穿出transwell小室细胞数明显多于对照组,差异有显著性(p值均<0.001)。

参考文献

[1]Women's intentions to receive cervical cancer screening with primary human papillomavirus testing[J].Gina S.Ogilvie;;Laurie W.Smith;;Dirk J.van Niekerk;;Fareeza Khurshed;;Mel Krajden;;Mona Saraiya;;Vivek Goel;;Barbara K.Rimer;;Sandra B.Greene;;Suzanne Hobbs;;Andrew J.Coldman;;Eduardo L.Franco.Int.J.Cancer,2013(12)

[2]Results of a community-based cervical cancer screening pilot project using human papillomavirus self-sampling in Kampala,Uganda[J].Gina S.Ogilvie;;Sheona Mitchell;;Musa Sekikubo;;Christine Biryabarema;;Josaphat Byamugisha;;Jose Jeronimo;;Dianne Miller;;Malcolm Steinberg;;Deborah M.Money.International Journal of Gynecology and Obstetrics,2013(2)

[3]Atypical chemokine receptors predict lymph node metastasis and prognosis in patients with cervical squamous cell cancer[J].Teng Hou;;Dongxia Liang;;Liqun Xu;;Xin Huang;;Yongwen Huang;;Yanna Zhang.Gynecologic Oncology,2013(1)

[4]Genetics and biomarkers in personalisation of lung cancer treatment[J].Rafael Rosell;;Trever G Bivona;;Niki Karachaliou.The Lancet,2013(9893)

[5]张蓉.细胞外分泌蛋白CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈组织中的表达和宫颈癌细胞中的作用机制研究[D].复旦大学,2013.