重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

牛肠激酶轻链简介^[1]

肠激酶（Enterokinase,EK）是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。在 pH 值（4.5～9.5）、温度 4～45℃范围内专一识别 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，并水解 Lys 后肽键。由于经 EK 裂解融合蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N 末端氨基酸序列，因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。但是天然的肠激酶来源有限，价格昂贵，并且提取分离的成本高，加之天然提取的肠激酶易被其它蛋白酶污染，在切割融合蛋白的同时可能又降解了目的产物，运用基因工程方法可以弥补这些不足。

牛肠激酶轻链生理特点^[1]

1939 年 Kunitz证实肠激酶是胰蛋白酶原的生理激活剂，而胰蛋白酶是消化系统其它许多酶原的激活剂，因此肠激酶被认为是消化系统重要的起始酶之一。一般认为EK 存在于小肠刷状缘细胞膜上，Zamolodchikova等认为 pro-EK 是由十二指肠酶激活的。病理研究发现，十二指肠与胰腺的回流液中富集 EK 会激活过多的胰蛋白酶原从而导致急性胰腺炎，而 EK 缺陷的机体将会有腹泻、呕吐、浮肿等症状，造成发育不良，导致血蛋白不足症和贫血。

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化^[2]

经过密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因,采用pET-39b(+)构建了融合表达载体,为有效纯化和回收目标蛋白,在sBEKLC的C末端添加了his标签.在大肠杆菌中进行成功表达,产量达到151.2 mg/L DsbA-sBEKLC,相当于80.6 mg/LsBEKLC.高表达的DsbA-sBEKLC融合蛋白虽然没有生物活性,但可用于复性来得到活性sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取蛋白,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mgsBEKLC,sBEKLC经检测具有生物活性,为重组肠激酶在融合蛋白纯化中的应用提供了可靠的物质基础.

参考文献

[1] 牛肠激酶轻基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达的研究

[2]重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化.黄磊