人胶质瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人胶质瘤细胞取材于1例男性脑部顶叶胶质瘤患者。倍增时间为41.03h，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100蛋白、波形蛋白阳性。

人胶质瘤细胞

人胶质瘤细胞培养步骤

一．人胶质瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：

1）准备DMEM-H培养基(DMEM-H:Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium(DME H-21 4.5g/Liter Glucose)，90%；优质胎牛血清，10%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

二．人胶质瘤细胞处理：

1）复苏人胶质瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人胶质瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人胶质瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人胶质瘤细胞可以用于NLRP3在人胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生物学行为的作用研究

研究检测了人胶质瘤组织中NLRP3的表达情况,并就NLRP3对胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的作用及可能的分子机制进行探讨。

材料与方法1.NLRP3炎性小体在人脑胶质瘤组织中的表达差异。应用免疫组化技术检测39例胶质瘤组织中NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的表达水平差异,数据采用Spearman秩相关分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2. NLRP3影响人胶质瘤细胞功能及其机制的初步研究。构建特异性敲低细胞内NLRP3的si-RNA序列及过表达NLRP3质粒载体,分别转染胶质瘤细胞SHG44及A172,Western Blot验证其有效性后,经克隆形成、CCK-8、EdU细胞增殖检测实验、流式细胞术、划痕实验、Transwell细胞迁移及侵袭实验,研究NLRP3低表达/高表达胶质瘤细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭功能的变化;通过Western Blot技术,检测ASC、caspase-1、IL-1β以及EMT相关的E-Cadherin、ZO-1、Claudin-1、N-Cadherin、vimetin及转录因子Snail是否因细胞内NLRP3表达水平的改变而发生变化,从而对NLRP3影响胶质瘤细胞功能的分子机制进行初步研究。

结果1.NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的组织表达水平与胶质瘤病理级别呈显著正相关。NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β在高级别胶质瘤组织中较低级别胶质瘤组织中表达水平上调,经Spearman秩相关检验,NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β的组织表达水平与胶质瘤WHO病理分级呈显著正相关。

3. NLRP3促进胶质瘤细胞的增殖、抑制凋亡、促进迁移与侵袭。(1)构建NLRP3特异性si-RNA及表达NLRP3的质粒载体,分别转染胶质瘤细胞系SHG44与A172,经Western Blot技术验证NLRP3低表达/高表达的胶质瘤细胞模型构建成功;

(2) 敲低NLRP3能够促进胶质瘤细胞的凋亡、抑制其增殖、迁移与侵袭,过表达NLRP3则表现出相反的效果,表现为抑制胶质瘤细胞的凋亡、促进其增殖、迁移与侵袭;

(3) 胶质瘤细胞中NLRP3表达被敲低后,ASC、pro-caspase-1及其活化剪切后亚基P20、pro-IL-1β及其成熟形式IL-1β的蛋白表达水平随之降低,同时细胞内E-Cadherin、ZO-1及Claudin-1表达增加,N-Cadherin、vimetin及snail下调;而过表达NLRP3后胶质瘤细胞内上述分子蛋白水平呈现相反的变化趋势。

结论1.NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的组织表达水平与胶质瘤病理级别呈显著正相关。

2. NLRP3通过抑制胶质瘤细胞凋亡、促进增殖、迁移与侵袭,在胶质瘤的发生发展中起作用。

3.NLRP3在胶质瘤中的作用可能与NLRP3炎性小体活性的变化以及NLRP3调控胶质瘤细胞发生EMT有关。

参考文献

[1]Role of STAT3 in Genesis and Progression of Human Malignant Gliomas[J].ZangbéwendéGuy Ouédraogo;;Julian Biau;;Jean-Louis Kemeny;;Laurent Morel;;Pierre Verrelle;;Emmanuel Chautard.Molecular Neurobiology,2017(8)

[2]Mechanism and Regulation of NLRP3 Inflammasome Activation[J].Yuan He;;Hideki Hara;;Gabriel Nú?ez.Trends in Biochemical Sciences,2016(12)

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[4]MicroRNA Regulation of Endothelial Junction Proteins and Clinical Consequence[J].Yugang Zhuang;;Hu Peng;;Victoria Mastej;;Weiguo Chen;;Yutong Zhao.Mediators of Inflammation,2016

[5]殷小凤.NLRP3在人胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞生物学行为的作用研究[D].南方医科大学,2017.