人结直肠腺癌上皮细胞的应用

背景[^1-3]

人结直肠腺癌上皮细胞是1977-1979年间D.L.Dexter和同事分离的两株结直肠腺癌细胞株中的一株。在ATCC和其它地方进行的DNA fingerprinting和染色体组型分析表明这株细胞与HCT-15(CCL-225)相似，说明这两者是来自同一个人的不同克隆。

他们的遗传起源可通过DNA fingerprinting证实，但染色体组型分析显示它们缺乏染色体标记一致改变或数目上一致改变。细胞的CSAp阴性(CSAp-)。DLD-1细胞的p53抗原表达呈阳性(p53抗原产生了一个C->T点突变导致241位的Ser->Phe)。

人结直肠腺癌上皮细胞

角蛋白免疫过氧化物酶染色阳性。癌基因c-myc,K-ras,H-ras,N-ras,myb,sis和fos的表达呈阳性。癌基因N-myc的表达未做检测。表达肿瘤特异性核基质蛋白CC-2,CC-3,CC-4,CC-5和CC-6。1979年提交到ATCC的培养物代数不明且污染了支原体。

其后经过12周多种抗生素联合培养处理。处理之后每周用Hoechst染色和标准培养法检测。其后连续11个月不加抗生素培养，所有的检测呈阴性。

人结直肠腺癌上皮细胞（DLD-1）培养步骤：

一．人结直肠腺癌上皮细胞（DLD-1）培养基及培养冻存条件准备：

1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。

下面T25瓶为例；

1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人结直肠腺癌上皮细胞可以用于Notch3、DLL1、CD133在结直肠腺癌组织中的表达及意义

检测Notch3、DLL1、CD133在正常人结直肠组织、结直肠腺瘤、结直肠腺癌组织中的表达情况,探讨以上指标在结直肠癌发生、发展过程中的作用及其与临床病理特征间的关系。

方法:采用免疫组织化学的方法检测12例正常结直肠黏膜、30例结直肠腺瘤、50例结直肠腺癌组织中Notch3、DLL1、CD133的表达情况,分析上述指标的表达与临床病理特征间的关系,并运用Spearman相关分析法对3组指标的表达情况进行相关性分析。结果:在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤、结直肠腺癌组织中Notch3的阳性表达率分别为8.3%(1/12)、26.7%(8/30)、64%(32/50);DLL1的阳性表达率分别为16.7%(2/12)、33.3%(10/30)、68.0%(34/50);CD133的阳性阳性表达率分别为8.3%(1/12)、36.7%(11/30)、54.0%(27/50)。

上述指标在腺癌组的阳性表达率均明显高于腺瘤组及正常组,差异具有统计学意义(P<0.05);腺瘤组与正常组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。Notch3、DLL1、CD133在结直肠腺癌组织中的表达与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及分化程度无关(P>0.05),而均与淋巴结转移有关,伴有淋巴结转移组阳性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.05),且Notch3和DLL1的表达与Dukes分期有关,Dukes分期分期越高阳性表达率越高(P<0.05),此外DLL1的表达与肿瘤浸润深度也有关,肿瘤浸润深度越深阳性表达率越高(P<0.05)。Notch3蛋白和CD133蛋白表达呈正相关关系(r=0.478,P<0.01)。其余指标间均无明显相关性。

结论:1.Notch3、DLL1、CD133在正常结直肠组织、结直肠腺瘤、结直肠腺癌组织中的表达呈逐渐递增趋势,他们可能参与了结直肠癌的发生、发展过程。

2. Notch3蛋白表达与淋巴结转移和Dukes分期有关,DLL1蛋白表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移有关,CD133蛋白表达与淋巴结转移有关;提示以上3个指标可有望成为新的肿瘤标志物推测结直肠癌患者的预后。

3.Notch3蛋白与CD133蛋白的表达存在明显正相关关系。

参考文献

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[3]The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt,Hedgehog,TGFβ/BMP and hypoxia pathways[J].Tilman Borggrefe;;Matthias Lauth;;An Zwijsen;;Danny Huylebroeck;;Franz Oswald;;Benedetto Daniele Giaimo.BBA-Molecular Cell Research,2015

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[5]蒋海涛.Notch3、DLL1、CD133在结直肠腺癌组织中的表达及意义[D].遵义医学院,2017.