人子宫颈癌的应用

背景^[1-3]

人子宫颈癌由N.Auersperg从一位66岁白人子宫癌患者的子宫颈中分离出来，是此次患者宫颈癌活组织检查中获得的一系列细胞系之一。细胞最初表现出亚二倍体核型及上皮细胞形态，连续传代可导致核型不稳定。

细胞内存在成视网膜细胞瘤蛋白(pRB)，但大小不正常；P53表达上调，第273位密码子突变，从而导致Arg氨基酸替换为Cys，经检测发现人乳头瘤病毒（HPV）DNA及RNA阴性。

人子宫颈癌

人子宫颈癌细胞培养步骤：

1）复苏人子宫颈癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL*培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）人子宫颈癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1、对于贴壁人子宫颈癌细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的*培养基终止消化。

3.轻轻吹打细胞，*脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。

2、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：

方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

方法二：可选择半数换液方式，弃去半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人子宫颈癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。

应用^[4][5]

人子宫颈癌细胞可以用于人子宫颈癌PD-L1的表达及其与肿瘤内浸润T细胞的相关性研究

采用免疫组织化学染色观察人体5例正常宫颈组织、7例高级别宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasiaⅡ-Ⅲ,CINⅡ-Ⅲ)组织和67例子宫颈癌组织PD-L1的表达和淋巴细胞PD-1的表达,免疫荧光染色观察了相应组织内浸润的CD4+T和CD8+T细胞数量,并通过TUNEL法检测了肿瘤内浸润淋巴细胞的凋亡情况。

研究结果显示正常子宫颈上皮不表达PD-L1;宫颈瘤变上皮不表达或弱阳性表达PD-L1,其相对积分光密度平均值为(0.82±0.75);70%(47/67)的宫颈癌表达PD-L1,浅表浸润(浸润深度<5mm)和深部浸润的宫颈鳞状细胞癌PD-L1的相对积分光密度平均值分别为(2.70±1.68)、(2.90±1.72)。CIN病灶和肿瘤内浸润的部分淋巴细胞表达PD-1。

子宫颈瘤变上皮与子宫颈鳞状细胞癌PD-L1表达存在明显差异(P<0.01),浅表浸润的子宫颈鳞状细胞癌PD-L1的表达略低于深部浸润的鳞状细胞癌,但无统计学差异;PD-L1阳性病例肿瘤局部浸润的CD8+T细胞数量显著减少,且PD-L1表达与CD8+T细胞数量明显负相关(r=-0.82,P<0.01),但与肿瘤局部CD4+T细胞数量无明显相关性(r=-0.05,P>0.05);虽然原发灶内宫颈癌细胞表达PD-L1,但淋巴结转移灶内的宫颈癌细胞不表达PD-L1;部分PD-L1阳性的子宫颈癌局部浸润的淋巴细胞存在凋亡现象。

本研究结论:子宫颈癌细胞异常表达PD-L1,且PD-L1的表达与肿瘤局部浸润的CD8+T细胞数量减少有关,但与浸润的CD4+T细胞数量无关。癌细胞PD-L1的表达与其淋巴结转移无关。癌细胞可能通过PD-L1/PD-1途径促进了肿瘤内浸润的T淋巴细胞凋亡。

参考文献

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[5]王渝琦.人子宫颈癌PD-L1的表达及其与肿瘤内浸润T细胞的相关性研究[D].重庆医科大学,2010.