大鼠肾小球系膜细胞的应用

背景^[1-3]

大鼠肾小球系膜细胞贴壁生长；大鼠肾小球系膜细胞常用于肾病发生机理的临床研究，也可用于构建动物摸型。

肾小球系膜是位于肾小球毛细血管襻中轴中心部位的一种特殊间充质组织，由间充质细胞和充填于其间的系膜基质所组成。由系膜细胞及系膜基质组成，为肾小球毛细血管丛小叶间的轴心组织，并与毛细血管的内皮直接相邻。系膜细胞呈星形，有多个突起，有丰富的细胞质。在单个系膜区系膜细胞不超过3个。系膜基质由系膜细胞产生，是一种基质样物质，占肾小球面积的6.2%～10.4%，其中的间隙形成系膜通道，可将不能通过肾小球滤过膜的大分子物质运至血管极排出。

大鼠肾小球系膜细胞

肾小球系膜有多种生理功能：

(1)对肾小球毛细血管袢有支持和保护作用；

(2)通过系膜的吞噬功能及系膜通道可将血浆大分子物质转运、清除；

(3)通过系膜细胞的收缩和舒张，控制毛细血管的血流量，调节肾小球的滤过功能及系膜通道功能；

(4)系膜细胞上具有Fc、C3b受体，可参与免疫反应；

(5)系膜细胞可释放多种炎症介质，通过自分泌及旁分泌途径参与肾小球炎症反应；

(6)系膜细胞可产生多种细胞外基质，参与基底膜的修复与更新，在病理情况下导致肾小球硬化。HBZY-1/大鼠肾小球系膜细胞EC(HBZY-1)常用于肾病发生机理的临床研究，也可用于构建动物摸型。

HBZY-1/大鼠肾小球系膜细胞EC(HBZY-1)传代建议：1：2~1：3传代，2~3天换液1次，细胞质检情况：不含细菌、真菌、支原体等微生物污染。HBZY-1/大鼠肾小球系膜细胞EC(HBZY-1)复苏步骤如下：

1）把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2）把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3）把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4）标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。5）3天换一次培养基。

HBZY-1/大鼠肾小球系膜细胞EC(HBZY-1)传代步骤如下：

1）培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2）把原有培养基吸掉。

3）加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

4）细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

5）用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

6）把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7）倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8）根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。继续培养。

应用^[4][5]

大鼠肾小球系膜细胞可以用于两色金鸡菊黄酮及主成分对高糖软脂酸诱导HBZY-1细胞能量代谢紊乱的调控作用研究

高糖软脂酸诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)细胞建立体外糖尿病肾病(DN)代谢紊乱细胞模型,探讨两色金鸡菊黄酮纯化物(Flavonoids of Coreopsis tinctoria Nutt,FC)及主成分马里苷对模型细胞能量代谢紊乱的保护作用及其机制研究。

方法:1.高糖软脂酸诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)建立体外DN模型,模型组采用葡萄糖100 mmol·L-1+软脂酸250μmol·L-1(HG+PA);

2. 黄酮纯化物(1)将HBZY-1细胞分为正常组(NC)、高糖软脂模型组(HG+PA)、FC不同剂量干预组FC+HG+PA(1、5、10、20、40、80、160、320μg/mL)。采用MTS实验检测FC不同剂量对模型细胞增殖的作用影响,倒置显微镜下观察各组细胞形态的改变;

(2) 细胞划痕实验观察FC对模型细胞中胞外基质(ECM)分泌的影响;

(3) Western blot法检测各组细胞中能量代谢调控因子活性5’腺苷一磷酸活化蛋白激酶α(p-AMPKα)、乙酰辅酶a羧化酶1(ACC1)、甾醇调节元件结合蛋白1(SREBP1);氧化应激因子:一氧化氮合酶(eNOS)、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)的表达。

3. 马里苷将细胞分为(1)正常对照组(NG)、模型组(HG+PA)、马里苷不同剂量组(25、50、100、200μmol·L-1)。采用MTS法检测马里苷对HBZY-1细胞增殖的影响,从中筛选最适给药浓度;

(2) Western blot法检测各组细胞中1).能量代谢因子p-AMPKα、AMPKγ1、ACC1、SREBP-1、SIRT3;2).氧化应激NOX4,炎症因子:MCP-1、ICAM-1,纤维化因子:FN、α-SMA、Collagen VI;3).TGF-β1/Smads信号通路;4).氧化应激RhoA/Rock信号通路蛋白的表达水平。

结果:1.FC能抑制高糖高脂诱导的HBZY-1细胞增殖,细胞间隙增大、密度显著降低;FC促进模型细胞中p-AMPKα、p-ACC1、eNOS的表达,抑制细胞中SREBP1、NOX4、ACC1的表达;划痕实验结果表明FC对模型细胞中ECM分泌有显著抑制作用,同时显著降低α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。

2. 马里苷抑制高糖软脂酸诱导的HBZY-1细胞增殖;AMPK信号通路激活,下调模型细胞中NOX4、MCP-1、ICAM-1、α-SMA、FN、CollagenⅥ、能量代谢通路因子SREBP-1、SIRT3、TGF-β1/Smads(Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4)、RhoA、p-MYPT1蛋白的表达;并上调p-AMPKα、AMPKγ1、p-ACC1的表达。

结论:1.两色金鸡菊黄酮纯化物可能通过调控能量代谢通路AMPK/SREBP-1/ACC1,抑制模型细胞增殖、氧化应激进而改善肾脏纤维化病变的作用。

2.马里苷可能通过激活AMPK信号通路,抑制HBZY-1细胞氧化应激、炎症反应、脂代谢以及纤维化蛋白的表达,延缓DN肾脏损伤。

参考文献

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