人成骨肉瘤细胞的应用

背景^[1-3]

人成骨肉瘤细胞是Fogh J和Trempe G分离和鉴定的众多人类肿瘤细胞系中的一种；该细胞来自一位11岁的白人女性的骨肉瘤组织。患者经过放疗以及氨甲喋呤、阿霉素、长春新碱、环磷酰胺和aramycin-C等多种药物治疗。该细胞在免疫抑制小鼠中不致瘤，细胞表达表皮生长因子EGF受体、转化生长因子β（1型和2型）受体。

人成骨肉瘤细胞

人成骨肉瘤细胞培养操作

1）复苏人成骨肉瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

2）人成骨肉瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人成骨肉瘤细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

4.将人成骨肉瘤细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）人成骨肉瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；

1.人成骨肉瘤细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。

2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。

3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。

应用^[4][5]

人成骨肉瘤细胞可以用于三氧化二砷对人成骨肉瘤细胞系MG-63趋化及粘附能力的影响

观察三氧化二砷对人成骨肉瘤细胞系MG-63迁移粘附及趋化能力的影响方法:常规培养人人成骨肉瘤细胞系MG-63;将骨肉瘤细胞分为三组对照:在实验组:加入浓度为1.0μmol/L的三氧化二砷溶液,将等体积浓度为15mg/L的5-氟尿嘧啶加入第二组,称为阳性对照组,第三组不放任何药物处理,只放入同等体积的培养液,称为阴性对照组;

1. 用细胞聚集实验方法来检测三个不同处理组骨肉瘤细胞之间的粘附能力大小,2.用层粘连蛋白实验来观察三个不同处理组骨肉瘤细胞与正常组织或细胞外基质的粘附能力的大小,3.骨肉瘤细胞的迁移和趋化能力用划痕实验及transwell小室法检测。采用SPSS17.0统计软件。计量资料以x±s表示,组间比较采用方差分析及LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果:振摇时间20min,40min,60min时,通过观察三个不同处理组前后骨肉瘤细胞聚集数量的变化,得出的骨肉瘤细胞的聚集指数分别为三氧化二砷处理组:0.24±0.030,0.47±0.059,0.59±0.070,阴性对照组的聚集指数为(0.14±0.011,0.18±0.015,0.22±0.023)而加入5-氟尿嘧啶的对照组的聚集指数为(0.16±0.012,0.20±0.024,0.33±0.23),三个对照组的结果经统计学分析。

证实有统计学意义,P<0.05,三氧化二砷组高于其他两组;层粘蛋白Ln粘附实验表明MG-63细胞系在培养30min时三组测的吸光度统计分析结果无意义,P>0.05,在培养60min时及培养90min时测得的细胞吸光度分别为实验组:0.144±0.007,0.141±0.013,未经药物处理的阴性对照组为0.387±0.026,0.461±0.024,5-氟尿嘧啶处理的阳性对照组为0.363±0.035,0.513±0.034,P<0.05,证实有统计学意义；

三氧化二砷组明显低于其他两组;划痕损伤愈合实验表明48小时后实验组在迁移距离、迁移面积及迁移速率为192.3±16.7,91.9±9.1,4.00±0.35,显著低于5-氟尿嘧啶对照组(301.6±23.8,161.9±12.9,6.9±0.9)及阴性对照组(362.0±27.8,242.5±21.2,8.2±1.1),证实有统计学意义,P<0.05;

观察计数穿过transwell小室的骨肉瘤细胞数,得出的结果为:实验组、阳性对照组、阴性对照组迁移跨膜细胞数分别为(112±11)、(172±15),(276±37)个,两两组间比较,P均<0.05,差异有统计学意义。

参考文献

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[2]Arsenic trioxide and all-trans retinoic acid target NPM1 mutant oncoprotein levels and induce apoptosis in NPM1-mutated AML cells[J].Maria Paola Martelli;;Ilaria Gionfriddo;;Federica Mezzasoma;;Francesca Milano;;Sara Pierangeli;;Floriana Mulas;;Roberta Pacini;;Alessia Tabarrini;;Valentina Pettirossi;;Roberta Rossi;;Calogero Vetro;;Lorenzo Brunetti;;Paolo Sportoletti;;Enrico Tiacci;;Francesco Di Raimondo;;Brunangelo Falini.Blood,2015(22)

[3]Arsenic trioxide during consolidation for patients with previously untreated low/intermediate risk acute promyelocytic leukaemia may eliminate the need for maintenance therapy[J].Steven E.Coutre;;Megan Othus;;Bayard Powell;;Cheryl L.Willman;;Wendy Stock;;Elisabeth Paietta;;Denise Levitan;;Meir Wetzler;;Eyal C.Attar;;Jessica K.Altman;;Steven D.Gore;;Tracy Maher;;Kenneth J.Kopecky;;Martin S.Tallman;;Richard A.Larson;;Frederick R.Appelbaum.Br J Haematol,2014(4)

[4]Treatment of paediatric APL:How does the therapeutic approach differ from adults?[J].Matthew A.Kutny;;John Gregory;;James H.Feusner.Best Practice&Research Clinical Haematology,2014(1)

[5]岳龙.三氧化二砷对人成骨肉瘤细胞系MG-63趋化及粘附能力的影响[D].山西医科大学,2016.