人小细胞肺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人小细胞肺癌细胞是一种典型的小细胞性肺癌细胞，表达较高水平的4种生化标志：神经特异性烯醇、肌酸激酶脑型同工酶、左旋多巴脱羧酶、铃蟾肽样免疫活性。c-mycDNA序列没有扩增；未发现大的结构DNA的异常；该细胞合成与正常肺相当量的p53mRNA。该细胞以聚集体的形式悬浮生长，只有聚集体中的细胞是有活力的，但是细胞活率无法估计，一般培养基中含有大量的细胞碎片。

人小细胞肺癌细胞

人小细胞肺癌细胞操作流程：

1、收到人小细胞肺癌细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置3-4小时以稳定细胞状态，然后换用新鲜完全培养液继续培养或进行传代。

2、人小细胞肺癌细胞传代：

1）人小细胞肺癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，然后放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待人小细胞肺癌细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、人小细胞肺癌细胞冻存：

1）人小细胞肺癌细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）用适量的冻存液（FBS：DMSO=9：1）重悬人小细胞肺癌细胞，并放置于冻存管中；

4）先将人小细胞肺癌细胞冻存管放置于-20℃1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。使用程序降温盒可直接放入-80℃。

4、人小细胞肺癌细胞复苏：

1）从液氮中取出人小细胞肺癌细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5min；

3）弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种25cm2培养瓶，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜完全培养基继续培养。

应用^[4][5]

人小细胞肺癌细胞可以用于分泌型去整合素金属蛋白酶ADAM12S促进小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制研究

定量蛋白组学和生化方法发现ADAM12S促进SCLC细胞增殖和转移的新机制目的:在SCLC细胞株中对ADAM12S调控的蛋白进行系统的鉴定,寻找ADAM12S影响SCLC细胞增殖和转移的关键蛋白。

方法:qRT-PCR方法检测不同SCLC细胞株中ADAM12S的mRNA水平,筛选出低表达和高表达的细胞株;

利用慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl构建ADAM12S过表达质粒,包装慢病毒、侵染ADAM12S低表达的H1688细胞株,利用流式细胞分选仪筛选稳定表达ADAM12S/ZsGreen和ZsGreen对照细胞株;CCK-8细胞增殖实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验研究ADAM12S对H1688细胞增殖和转移的影响:采用细胞培养稳定同位素标记氨基酸(Stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)技术标记对照组和ADAM12S过表达组细胞,用Orbitrap质谱仪分析酶解的多肽组份,用蛋白质分析软件MaxQuant搜索数据库鉴定蛋白质,根据SILAC标记获得各个蛋白质在两个样品中的相对丰度,获得SCLC细胞中ADAM12S过表达后显著变化的蛋白;

利用DAVID数据库分析ADAM12S调控的蛋白,分析ADAM12S所参与的生物学功能以及胞内信号通路;

Western Blotting(WB)验证质谱获得的差异较大且与细胞增殖、迁移和侵袭相关的调控蛋白;qRT-PCR方法验证质谱鉴定上调的Ⅰ型己糖激酶(Hexokinase I,HK1)的mRNA水平;WB方法检测HK1转录因子c-Myc的蛋白水平以及上游通路Akt/ERK的蛋白和磷酸化水平;

在高表达ADAM12S的细胞株中用siRNA敲低ADAM12S观察HK1的变化;siRNA敲低HK1后观察ADAM12S对细胞增殖、迁移和侵袭的影响;构建敲低HK1的shRNA慢病毒质粒,在稳定过表达ADAM12S的H1688细胞株中敲低HK1,进行克隆形成实验;

同时在shRNA稳定敲低HK1的细胞株中检测细胞的乳酸代谢和葡萄糖摄取能力。

研究结果:通过三次生物学重复和定量分析共鉴定到了70个ADAM12S调控的蛋白,并对这些调控蛋白进行生物学功能分析,发现其中许多蛋白参与三羧酸循环、糖异生、糖酵解等代谢途径。

生物化学方法验证了微囊蛋白1(Caveolin-1,CAV1)、半胱氨酸甘氨酸丰富蛋白1(Cysteine and glycine-rich protein 1,CSRP1)、膜联蛋白A6(Annexin A6,ANXA6)、谷氨酸草酰乙酸转氨酶1(Aspartate aminotransferase,GOT1)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase,G6PD)以及HK1等蛋白与ADAM12S的调控关系,与质谱结果一致,均被ADAM12S上调。在多种与代谢相关的蛋白中,发现糖酵解途径关键限速酶HK1与肿瘤的发生发展密切相关。在H1688细胞株中过表达ADAM12S后,HK1 amRNA水平和蛋白水平均显著上调,而HK2没有上调趋势;在H446细胞中敲低ADAM12S,HK1蛋白水平下调;

乳酸代谢和葡萄糖摄取实验结果显示,过表达ADAM12S,乳酸代谢和葡萄糖摄取均上调,但敲低HK1后,上调作用被明显抑制。增殖、迁移和侵袭实验表明,当敲低HK1后,ADM12S引起的增殖、迁移和侵袭均下降,而且ADAM12S对克隆形成的促进作用也被显著抑制。

参考文献

[1]Extracellular matrix(ECM)stiffness and degradation as cancer drivers[J].Masoud Najafi;;Bagher Farhood;;Keywan Mortezaee.Journal of Cellular Biochemistry,2019(3)

[2]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD;;Jacques Ferlay ME;;Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD;;Rebecca L.Siegel MPH;;Lindsey A.Torre MSPH;;Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2018(6)

[3]The Notch Pathway in Breast Cancer Progression[J].Emmanuel N.Kontomanolis;;Sofia Kalagasidou;;Stamatia Pouliliou;;Xanthoula Anthoulaki;;Nikolaos Georgiou;;Valentinos Papamanolis;;Zacharias N.Fasoulakis;;Ronald M.Bukowski.The Scientific World Journal,2018

[4]MicroRNA?126 inhibits proliferation and metastasis in prostate cancervia regulation of ADAM9[J].Yibo Hua;;Chao Liang;;Chenkui Miao;;Shangqian Wang;;Shifeng Su;;Pengfei Shao;;Bianjiang Liu;;Meiling Bao;;Jundong Zhu;;Aiming Xu;;Jianzhong Zhang;;Jie Li;;Zengjun Wang.Oncology Letters,2018(6)

[5]段欠欠.分泌型去整合素金属蛋白酶ADAM12S促进小细胞肺癌细胞增殖和转移的分子机制研究[D].苏州大学,2019