人甲状腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人甲状腺癌细胞源自一名42岁患有滤泡状甲状腺癌的男性的淋巴结转移灶。表达甲状腺球蛋白、EGFR，P53突变。碘131辐射可使FTC-133细胞摄碘能力下降。FTC-133细胞系常用于甲状腺癌的相关研究，尤其在药物抑制和促癌细胞凋亡方面有重要研究意义。

人甲状腺癌细胞

人甲状腺癌细胞培养步骤：

1)人甲状腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：

1.准备DMEM-H培养基（添加NaHC031.5g/L)，90%;胎牛血清，10%。

2.人甲状腺癌细胞培养条件：气相：空气，95%;二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3.人甲状腺癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO,现用现配。液氮储存。

2)人甲状腺癌细胞处理：

复苏人甲状腺癌细胞：将含有lmL细胞悬液的冻存管在37°C水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加l-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入l〇cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。

人甲状腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁人甲状腺癌细胞，传代可参考以下方法：

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。力口2m丨消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA)于培养瓶中，置于37°C培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加l-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

人甲状腺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约lml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加1〇%DMSO后进行冻存。

应用^[4][5]

人甲状腺癌细胞可以用于甘露糖结合凝集素对甲状腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达影响的研究

用不同浓度的甘露糖结合凝集素(Mannan-binding lectin,MBL)分别作用于甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133),采用4-甲基偶氮四唑蓝(MTT法)检测细胞增殖,选择适量的浓度及作用时间,应用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞凋亡,蛋白印记法(Western blot)检测两种癌细胞中Bcl-2和p53蛋白表达,探讨MBL与甲状腺肿瘤细胞增殖、凋亡的关系,为MBL用于防治甲状腺肿瘤提供理论依据。

方法:1细胞培养:人甲状腺乳头状癌(K1)和甲状腺滤泡状癌(FTC-133)细胞,分别培养于含有10%胎牛血清,100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素、DMEM:F12:MCDB105(2:1:1)和DMEM-F12(1:1)的培养基中,37℃、5%CO2培养箱培养,23天换液1次。用0.25%胰酶常规消化传代,取对数生长期细胞进行实验。

2 MTT法检测细胞增殖:分别将甲状腺乳头状癌细胞(K1)、甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)与不同浓度的MBL(浓度分别为0、0.01、0.1、1、10ug/ml,每个浓度设5个复孔,0ug/LMBL为对照组)共培养12、24、48h后,MTT细胞增殖试验检测MBL对两种细胞生长的影响。

3流式细胞术检测细胞凋亡率:将甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)分别与0、1ug/mlMBL共培养48h后,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法观察MBL对两种甲状腺癌细胞凋亡的影响。

4 Bcl-2及p53基因蛋白表达的测定:提取实验组与对照组细胞中的总蛋白,以β-actin作为内参,蛋白印记法(Western blot)测定1ug/mlMBL分别作用于甲状腺乳头状癌细胞(K1)和甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133)48h后,Bcl-2及p53基因蛋白的相对表达量。

结果:1 MTT法检测结果:MBL作用于甲状腺乳头状癌及甲状腺滤泡状癌细胞后,各组细胞生长均受到抑制,并呈剂量、时间依赖关系。

2流式细胞术检测细胞凋亡率:MBL作用于甲状腺乳头状癌(FTC-133)及甲状腺滤泡状癌细胞(K1),检测到明显的凋亡峰,1ug/ml的MBL作用48h后甲状腺乳头状癌细胞(FTC-133)凋亡率为(12.87±0.47)%,而未经MBL作用的对照组凋亡率为(5.15±0.52)%,二者差异具有统计学意义(p<0.05)。1ug/ml的MBL作用48h后甲状腺滤泡状癌细胞(K1)凋亡率为(9.36±0.35)%,而未经MBL作用的对照组凋亡率为(3.24±0.71)%,二者差异具有统计学意义(p<0.05)。

3 Bcl-2及p53基因蛋白表达的测定

3.1 Bcl-2蛋白的相对表达量

3.1.1甲状腺乳头状癌细胞(K1):Western blot结果显示26KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.20±0.07),实验组为:(0.59±0.04),实验组与对照组相比Bcl-2蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.1.2甲状腺滤泡状癌细胞(FTC-133):Western blot结果显示26KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.07±0.11),实验组为:(0.33±0.06),实验组与对照组相比Bcl-2蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.2 p53蛋白的相对表达量

3.2.1甲状腺乳头状癌细胞(K1):Western blot结果显示53KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(1.51±0.29),实验组为:(0.74±0.07),实验组与对照组相比p53蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

3.2.2甲状腺滤泡状癌(FTC-133):Western blot结果显示53KD处有一个条带,密度扫描分析结果对照组为:(0.88±0.14),实验组为:(0.35±0.08),实验组与对照组相比p53蛋白相对表达量明显下调,差异有统计学意义(p<0.05)。

结论:1 MBL在体外具有抑制甲状腺乳头状癌细胞及甲状腺滤泡状癌细胞增殖的作用,这种作用与剂量、时间呈正相关。

2 MBL在体外可促进甲状腺乳头状癌细胞及甲状腺滤泡状癌细胞凋亡,为以后MBL用于甲状腺癌防治提供理论基础。

3 MBL可诱导甲状腺癌细胞凋亡、抑制其增殖,在其诱导甲状腺癌细胞凋亡、促进其增殖的的过程中,Bcl-2和p53可能发挥着一定的作用。

参考文献

[1]The impact of p53 and p73 on aneuploidy and cancer[J].Richard Tomasini;;Tak W.Mak;;Gerry Melino.Trends in Cell Biology,2008(5)

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[3]Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy[J].Isabel Marzo;;Javier Naval.Biochemical Pharmacology,2008(8)

[4]MBL2 and MASP2 gene polymorphisms in patients with hepatocellular carcinoma[J].L.Segat;A.Fabris;L.Padovan;M.Milanese;D.Pirulli;F.Lupo;M.Salizzoni;A.Amoroso;S.Crovella.Journal of Viral Hepatitis,2008(5)

[5]韩颖.甘露糖结合凝集素对甲状腺癌细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达影响的研究[D].河北医科大学,2011.