结合/洗脱缓冲液 (PH 8.0)用于HIS-Tag 重组蛋白纯化的过程

纯化过程^[1]

为了大量获得融合 His Tag 的重组蛋白质用于开发高效实用的复性方法，本利用 PCR 技术体外扩增了大肠杆菌 DH5α 染色体 DNA 中的苹果酸脱氢酶的编码基因、质粒 pEGFP-C1 中的增强型绿色荧光蛋白的目标基因以及牛胰腺全 DNA组中的核糖核酸酶 A 的 DNA，并通过 Bam HI 与 HindIII 酶切位点将其与质粒载体 p ET28a 连接，构建出 p ET28a 的重组质粒（p ET28a-MDH，pET28a-EGFP 和pET28a-RNase A）。

将重组质粒转入 E.coli BL21（DE3）中，分别得到可以启动T7 promoter 表达目标蛋白质（MDH 和 EGFP）的基因工程菌（a MN3 和 a EN5）。通过对表达菌培养时间、诱导时机等条件的优化，得到表达菌 a MN3 的诱导条件：菌体 37℃培养 4h 后加入 1mmol/L IPTG，37℃诱导 9h；表达菌 a EN5诱导条件：菌体 37℃培养 4h 后加入 1mmol/L  IPTG，37℃诱导 3h。

对表达产物的分析发现，高效表达的目标蛋白产物（MDH 和 EGFP）在菌体内主要以包涵体形式存在，但也有部分可溶蛋白表达。经 SDS-PAGE 凝胶电泳胶密度面积扫描分析得到 MDH 占全菌蛋白的 63.0％，EGFP 占全菌蛋白的 49.7％，包涵体蛋白的产量分别为 153.3 mg/(L 培养液)和 140.3mg/(L 培养液)。

亲和分离^[1]

由于表达产物带有 6 个His  Tag，因此利用固定化金属亲和色谱（Chelating SepharoseTM  Fast  Flow）对表达产物（MDH和EGFP）进行了亲和分离和复性的前期探索性实验。结果表明，固定化金属亲和色谱能够较好的吸附可溶性表达蛋白质和经脲变性的包涵体蛋白质，并可被结合/洗脱缓冲液 (PH 8.0)洗脱缓冲液有效洗脱，得到了较好的分离纯化效果。

参考文献

[1] 融合 His Tag 重组蛋白的基因克隆、表达及亲和纯化