人肾上腺皮质腺癌细胞的应用

背景^[1-3]

人肾上腺皮质腺癌细胞是源于多能肾上腺皮质癌细胞系NCI-H295细胞，后者由Gazdar·A·F等建立，从肾上腺皮质的肿瘤中分离而来。NCI-H295细胞经改变培养条件获得了NCI-295R细胞，群体倍增时间从原来的5天减为2天。NCI-295细胞悬浮生长，而NCI-H295R细胞呈单层贴壁生长。NCI-H295R细胞保留了产生雄激素的能力，对血管紧张素Ⅱ和钾离子有反应。

人肾上腺皮质腺癌细胞

人肾上腺皮质腺癌细胞处理：

1.冻存人肾上腺皮质腺癌细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2.人肾上腺皮质腺癌细胞传代：如果细胞密度达70%-90%，即可进行传代培养。

该细胞为贴壁人肾上腺皮质腺癌细胞，传代可以参考以下方法：

(1)弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

(2)加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。

(3)轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

3.人肾上腺皮质腺癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例：

(1)细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml。

(2)1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

(3)将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

应用^[4][5]

人肾上腺皮质腺癌细胞可以用于靶向沉默CTNNB1基因对肾上腺皮质腺癌H295R细胞增殖及醛固酮分泌影响

通过细胞水平实验探究CTNNB1基因对肾上腺皮质腺癌H295R细胞增殖及醛固酮分泌的影响,为探索APA可能的发病机制提供一定的基础。

方法:利用RNAi技术,以pGLMV-SC5 RNAi慢病毒为载体,靶向沉默CTNNB1基因。实验分为4组:空载组(Control组)、CTNNB1基因(β-catenin)沉默组(si-β-catenin组)、加入血管紧张素Ⅱ刺激的空载组(Control+AngⅡ组)和加入血管紧张素Ⅱ刺激的CTNNB1基因(β-catenin)沉默组(si-β-catenin+AngⅡ组)。用倒置显微镜及荧光显微镜观察各组细胞生长及荧光表达情况,利用q RT-PCR以及Western blot检测各组H295R细胞CYP11B2、CYP11B1、AXIN2、LEF1以及Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平;利用ELISA检测各组细胞上清液中醛固酮的表达量;利用CCK-8和细胞克隆形成实验检测各组细胞增殖能力。收集、整理实验数据,用SPSS13.0进行统计学分析。

结果:靶向沉默CTNNB1基因成功下调肾上腺皮质腺癌H295R细胞β-catenin的表达。与空载组相比,CTNNB1基因沉默组中β-catenin的mRNA及蛋白表达水平明显下降(P<0.001)。与Control组相比,si-β-catenin组的AXIN2和LEF1的mRNA表达水平明显下降(P<0.01);Western blot结果显示si-β-catenin组的AXIN2和LEF1的蛋白水平也显著下降。

与Control+AngⅡ组相比,si-β-catenin+AngⅡ组的AXIN2和LEF1的表达量进一步下降,提示靶向沉默CTNNB1基因使Wnt/β-catenin信号通路活性降低。与Control组相比,si-β-catenin组的CYP11B2 mRNA表达量降低(P<0.001),在血管紧张素Ⅱ刺激下,Control+AngⅡ组的CYP11B2 mRNA表达量明显高于si-β-catenin+AngⅡ组(P<0.001),但Control组与si-β-catenin组的CYP11B1 mRNA表达量无明显差异(P>0.05),加入血管紧张素Ⅱ刺激后,Control+AngⅡ组与si-β-catenin+AngⅡ组的CYP11B1mRNA表达量均增加,但两组之间仍无明显差异(P>0.05);Western blot结果显示沉默CTNNB1基因可显著降低CYP11B2的表达,但对CYP11B1的表达无明显影响。

各组H295R细胞上清液中醛固酮表达量显示,Control组:51.477±1.977 ng/ml,si-β-catenin组:48.830±1.557 ng/ml,Control+AngⅡ组:80.938±3.092ng/ml,si-β-catenin+AngⅡ组:56.161±2.725 ng/ml。

与Control组相比,si-β-catenin组上清液中醛固酮的表达量下降12.91%(P<0.05);在血管紧张素Ⅱ刺激下,si-β-catenin+AngⅡ组的醛固酮表达量相较于Control+AngⅡ组下降30.61%(P<0.001)。

Cyclin D1是调控细胞周期,影响细胞增殖的关键蛋白,本研究测定各组Cyclin D1的mRNA及蛋白表达水平显示,si-β-catenin组的Cyclin D1 mRNA表达水平明显低于Control组(P<0.01),加入血管紧张素Ⅱ刺激后,Control+AngⅡ组与Control组的Cyclin D1 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05),si-β-catenin+AngⅡ组的Cyclin D1 mRNA表达水平比Control+AngⅡ组明显降低(P<0.01);Western blot结果显示沉默CTNNB1基因可显著降低Cyclin D1的蛋白表达水平。CCK-8增殖实验结果显示,si-β-catenin组细胞增殖能力明显低于Control组(P<0.01);细胞克隆形成实验显示,si-β-catenin组细胞克隆数明显少于Control组(P<0.01)。

结论:β-catenin是Wnt通路的核心分子,靶向沉默CTNNB1基因使β-catenin合成减少,Wnt/β-catenin信号通路活性降低。靶向沉默CTNNB1基因可显著降低H295R细胞CYP11B2的表达,减少醛固酮分泌,降低H295R细胞对血管紧张素Ⅱ的反应性,但是对CYP11B1的表达无明显影响。靶向沉默CTNNB1基因可降低β-catenin依赖性LEF/TCF的转录活性,减少下游细胞周期蛋白Cyclin D1的表达,从而阻碍细胞从G1期进入S期,最终抑制H295R细胞的增殖。

参考文献

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[5]罗鹏伟.靶向沉默CTNNB1基因对肾上腺皮质腺癌H295R细胞增殖及醛固酮分泌影响[D].西南医科大学,2019.